[發明專利]一種用于單精子冷凍保存的空心瓊脂糖球及制備方法

在審

• 申請號: 201910725118.3
• 申請日: 2019-08-07
• 公開（公告）號: CN110367243A
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發明（設計）人: 李博;陳書強;蘆潔;李麗;唐娜
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 北京匯捷知識產權代理事務所(普通合伙) 11531
• 代理人: 于鵬

1.一種用于單精子冷凍保存的空心瓊脂糖球，其特征是：該空心瓊脂糖球的制備是：

步驟1)取10ml的海藻酸和碳酸鈣的水溶液與20ml的含有卵磷脂及醋酸的石蠟油混合，得混合液；其中，水溶液中海藻酸為3％，碳酸鈣為0.6％；石蠟油中卵磷脂為3％，醋酸為0.5％；上述百分比均為質量百分比；

步驟2)將步驟1)的混合液過150目篩網，得到直徑在60–100μm的海藻膠小球；

步驟3)將步驟2)的海藻膠小球加入10ml質量百分比濃度為1％的瓊脂糖溶液中，加熱沸騰；

步驟4)將步驟3)含海藻膠小球的瓊脂糖溶液注入到磁力攪拌的10ml石蠟油中，形成瓊脂糖小球，待瓊脂糖小球冷卻后過150目篩網得到直徑在80–120μm的瓊脂糖小球；

步驟5)將直徑在80–120μm的瓊脂糖小球用清水洗凈后加入50ml的檸檬酸溶液，檸檬酸溶液將瓊脂糖小球中的海藻膠溶解后得到空心瓊脂糖球。

2.根據權利要求1所述的一種用于單精子冷凍保存的空心瓊脂糖球，其特征是：所述步驟4)含海藻膠小球的瓊脂糖溶液是通過1ml針管進行注入。

3.一種用于單精子冷凍保存的方法，其特征是：利用如權利要求1或2所述的用于單精子冷凍保存的空心瓊脂糖球，通過持針將該空心瓊脂糖球固定，將篩選的精子注射入空心瓊脂糖球中；將內有精子的空心瓊脂糖球，轉移至冷凍載桿上；然后將裝有空心瓊脂糖球的冷凍載桿，置于液氮泡沫盒上方10cm處開始熏蒸，經5min逐漸下降至液氮蒸汽內，再靜置1min后，將冷凍載桿投入液氮，可長期保存。

4.根據權利要求3所述的一種用于單精子冷凍保存的方法，其特征是：具體包括如下步驟：

步驟S1：精子冷凍皿的制備

精子冷凍皿的制備：皿內包含一個PVP滴和數個精子注射滴，以及一個平鋪的精子篩選滴，在無CO₂的37℃培養箱內過夜平衡，備用；其中，數個精子注射滴是用含10％SSS的m-HTF做成的液滴；

步驟S2：精子冷凍液的準備

不含蛋黃的精子冷凍液以1：1的比例用含10％SSS的m-HTF稀釋而成；

步驟S3：精子解凍液的準備

添加1ml含10％SSS的mHTF液體于雙井皿中，在無CO₂的37℃培養箱內過夜平衡，備用；

步驟S4：精子注射和冷凍

①在400X的放大倍數下，篩選活力好且無形態學畸形的精子；

②通過持針將空心瓊脂糖球固定，將篩選的精子注射入到空心瓊脂糖球中，根據具體情況，注射入1-5條精子；

③將內有精子的空心瓊脂糖球，轉移至冷凍載桿上，每個載桿裝載1-3枚空心瓊脂糖球；

④用鑷子夾持裝有空心瓊脂糖球的冷凍載桿，置于液氮泡沫盒上方10cm處開始熏蒸，經5min逐漸下降至液氮蒸汽內，再靜置1min后，將冷凍載桿投入液氮，可長期保存。

5.根據權利要求3或4所述的一種用于單精子冷凍保存的方法，其特征是：所述的精子為人類精子或非人類哺乳動物的精子。