[發明專利]雙色熒光示蹤膠質瘤干細胞微環境模型的制備方法

在審

• 申請號: 201910724265.9
• 申請日: 2019-08-07
• 公開（公告）號: CN110499294A
• 公開（公告）日: 2019-11-26
• 發明（設計）人: 董軍;王海洋;施佳;劉亮;姜倩倩;黃強
• 申請（專利權）人: 蘇州大學附屬第二醫院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;G01N21/64;C12Q1/02
• 代理公司: 11400 北京商專永信知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 高之波<國際申請>=<國際公布>=<進入

本發明公開了雙色熒光示蹤膠質瘤干細胞微環境模型的制備方法。該制備方法包括體外培養GSCs；將具有嘌呤霉素抗性的慢病毒轉染紅色熒光蛋白(RFP)基因于GSCs；將穩定表達RFP的GSCs接種至全身表達綠色熒光蛋白(GFP)balb/c裸小鼠體內，構建雙色熒光示蹤異種移植瘤模型；將穩定表達RFP的GSCs與全身表達綠色熒光蛋白(GFP)balb/c裸小鼠骨髓細胞體外共培養，構建雙色熒光示蹤體外細胞共培養模型；熒光共聚焦顯微鏡下觀察兩種熒光細胞的相互作用。本發明具有通過兩種熒光分別標記膠質瘤干細胞與微環境中間質細胞，使二者在細胞層面上的相互作用，在熒光顯微鏡下可見，為體內體外腫瘤微環境的研究提供了一種有效的研究方法的效果。

技術領域

本發明涉及醫療生物標記技術領域，特別涉及雙色熒光示蹤膠質瘤干細胞微環境的制備方法。

背景技術

膠質瘤是顱內發病率最高的惡性腫瘤，約占中樞神經系統原發腫瘤的43％～50％。其中膠質母細胞瘤(glioblastoma，GBM)因常伴有對周圍組織的侵襲和破壞，所以預后極差，中位生存期僅為14.6個月。膠質瘤干細胞(Glioblastoma stem cells，GSCs)及其微環境的相互作用是促進膠質瘤進展的重要因素。研究表明GSCs可誘導微環境中的間質細胞發生惡性轉化，這可能是膠質母細胞瘤易復發的潛在因素。間質細胞發生惡性轉化的可能性機制歸納如下：1)GSCs通過與微環境中間質細胞直接接觸，直接誘導間質細胞發生惡變。2)膠質瘤微環境中GSCs可與間質細胞發生相互作用并發生細胞融合，從而使正常間質細胞具有了腫瘤細胞的惡性表型。3)GSCs可向膠質瘤微環境中釋放外泌體，間質細胞通過吞噬這些外泌體使自身發生惡性轉化。

膠質瘤在微環境研究的難點在于并不能直接觀察GSCs與微環境中的間質細胞之間的相互作用。因此，建立雙色熒光示蹤GSCs微環境模型為分別示蹤腫瘤細胞與間質細胞提供了可視化的研究平臺，這對GBM發生發展的分子機制和腫瘤微環境等目前熱議的研究方向具有重要意義。

發明內容

鑒于在膠質瘤微環境中，觀察膠質瘤干細胞與腫瘤微環境中間質細胞之間相互作用存在困難，根據本發明的一個方面，提供了一種雙色熒光示蹤膠質瘤干細胞微環境的制備方法，此方法分別用兩種熒光標記腫瘤干細胞與間質細胞，從而可直接觀察二者之間的相互作用。

該雙色熒光示蹤膠質瘤干細胞微環境的制備方法至少包括以下步驟：

S1.體外培養GSCs

S2.將具有嘌呤霉素抗性的慢病毒轉染紅色熒光蛋白(RFP)基因于GSCs

S3.將穩定表達RFP的GSCs接種至全身表達綠色熒光蛋白(GFP)balb/c裸小鼠體內，構建雙色熒光示蹤異種移植瘤模型。

S4.將穩定表達RFP的GSCs與全身表達綠色熒光蛋白(GFP)balb/c裸小鼠骨髓細胞體外共培養，構建雙色熒光示蹤體外細胞共培養模型。

S5.熒光共聚焦顯微鏡下觀察兩種熒光細胞的相互作用。

上述的雙色熒光示蹤膠質瘤干細胞微環境的制備方法，其有益效果是，通過兩種熒光分別標記膠質瘤干細胞與微環境中間質細胞，使二者在細胞層面上的相互作用，在熒光顯微鏡下可見。為體內體外腫瘤微環境的研究提供了一種有效的研究方法。

在一些實施方式中，S1中，首先配制干細胞培養基，即添加有濃度為20ng/mlbFGF，20ng/ml EGF，1×B27細胞添加劑的DMEM/F12培養液，另需在培養液中加入1×谷氨酸、復合維生素、丙酮酸鈉、非必須氨基酸。雙抗可根據具體情況選擇性添加。