[發明專利]雙色熒光示蹤膠質瘤干細胞微環境模型的制備方法

在審

• 申請號: 201910724265.9
• 申請日: 2019-08-07
• 公開（公告）號: CN110499294A
• 公開（公告）日: 2019-11-26
• 發明（設計）人: 董軍;王海洋;施佳;劉亮;姜倩倩;黃強
• 申請（專利權）人: 蘇州大學附屬第二醫院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;G01N21/64;C12Q1/02
• 代理公司: 11400 北京商專永信知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 高之波<國際申請>=<國際公布>=<進入

1.雙色熒光示蹤膠質瘤干細胞微環境模型的制備方法，其特征在于，包括以下步驟，

S1，體外培養GSCs；

S2，將具有嘌呤霉素抗性的慢病毒轉染紅色熒光蛋白(RFP)基因于GSCs；

S3，將穩定表達RFP的GSCs接種至全身表達綠色熒光蛋白(GFP)balb/c裸小鼠體內，構建雙色熒光示蹤異種移植瘤模型；

S4，將穩定表達RFP的GSCs與全身表達綠色熒光蛋白(GFP)balb/c裸小鼠骨髓細胞體外共培養，構建雙色熒光示蹤體外細胞共培養模型；

S5，熒光共聚焦顯微鏡下觀察兩種熒光細胞的相互作用。

2.根據權利要求1所述的雙色熒光示蹤膠質瘤干細胞微環境模型的制備方法，其特征在于，所述S1中，首先配制干細胞培養基，即添加有bFGF、EGF、B27細胞添加劑的DMEM/F12培養液，另需在培養液中加入谷氨酸、復合維生素、丙酮酸鈉、非必須氨基酸或雙抗中的一種或多種。

3.根據權利要求2所述的雙色熒光示蹤膠質瘤干細胞微環境模型的制備方法，其特征在于，所述S1中，干細胞培養過程中，進行干細胞傳代培養，即將干細胞懸液離心，去除上清，加入Accutase消化液，孵育，將干細胞球吹打成單細胞懸液，離心去除上清，加入干細胞培養液懸浮細胞，CO2細胞培養箱中繼續培養。

4.根據權利要求3所述的雙色熒光示蹤膠質瘤干細胞微環境模型的制備方法，其特征在于，所述S2中，將處于對數生長期的干細胞懸液離心，去除上清，Accutase消化液在細胞培養箱中孵育，移液槍輕柔吹打干細胞球成單細胞懸液，接種于孔板，同時加入PBS濃度梯度稀釋的病毒液，混合均勻后放入細胞培養箱中；

慢病毒轉染細胞24h左右換液，離心干細胞懸液，去除上清，加入新鮮干細胞培養液重懸干細胞，轉染48h后熒光顯微鏡下觀察細胞轉染效率；

根據不同稀釋濃度的病毒及細胞生長狀態，選擇最佳適宜稀釋濃度進行轉染；

熒光顯微鏡下觀察細胞轉染效率大于70-80％時，加入嘌呤霉素，以殺滅為轉染細胞，使接近100％的細胞均表達RFP。

5.根據權利要求4所述的雙色熒光示蹤膠質瘤干細胞微環境模型的制備方法，其特征在于，所述S3中，選擇4-6周齡的全身表達綠色熒光蛋白(GFP)balb/c雄性裸小鼠，水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后，酒精消毒皮膚；

計數處于對數生長期的穩定表達RFP的GSCs，每只裸小鼠接種107個細胞，分別接種于小鼠顱內、腹腔及皮下；

致瘤成功后，活體動物成像儀下觀察異種移植瘤。

6.根據權利要求5所述的雙色熒光示蹤膠質瘤干細胞微環境模型的制備方法，其特征在于，所述S3中，斷頸處死荷瘤鼠，切去移植瘤，直接用OCT(optimalcutting temperaturecompound)包埋，冰凍保存；用冰凍切片機切片OCT包埋的移植瘤組織，并與熒光共聚焦顯微鏡下觀察GSCs-RFP與表達GFP的間質細胞。

7.根據權利要求6所述的雙色熒光示蹤膠質瘤干細胞微環境模型的制備方法，其特征在于，所述S4中，取4-6周齡表達綠色熒光蛋白(GFP)balb/c裸小鼠，麻醉后斷頸處死，離斷小鼠股骨和脛骨并在乙醇中浸泡，無菌條件下剝離附著的皮膚、筋膜和肌肉；

用含1％雙抗的PBS緩沖液沖洗后，切開股骨和脛骨干骺端；用注射器吸取部分胎牛血清的DMEM完全培養基，插入干骺端反復沖洗骨腔，直到骨透明為止；用完全培養基于CO2細胞培養箱中繼續培養骨髓細胞；

分別計數GSCs-RFP與表達GFP的骨髓細胞，將GSCs與骨髓細胞按比例共培養于同一細胞培養皿中；熒光顯微鏡及活細胞工作站下觀察兩種細胞的相互作用。