[發(fā)明專利]一種展示CyHV-2膜蛋白的重組桿狀病毒及其制備方法和應用

有效

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• 申請日: 2019-08-07
• 公開（公告）號: CN110452926B
• 公開（公告）日: 2022-06-17
• 發(fā)明（設計）人: 陳紅英;曹志偉;南昊;許曉東
• 申請（專利權）人: 西北農(nóng)林科技大學
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;A61K39/245;A61P31/22
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產(chǎn)權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

本發(fā)明公開了一種展示CyHV?2膜蛋白的重組桿狀病毒及其制備方法和應用，ORF25在桿狀病毒表面的展示通過將ORF25的胞外區(qū)與桿狀病毒AcMNPV gp64的信號肽和跨膜區(qū)進行融合表達來實現(xiàn)，重組桿狀病毒為載體表達的ORF25融合蛋白的氨基酸序列為SEQ IDNO:3。本發(fā)明以截短的CyHV?2糖蛋白ORF25為抗原基因，構建重組桿狀病毒，成功將ORF25展示在病毒表面。用該重組病毒轉導鯽魚細胞，ORF25在鯽魚細胞表達并展示在細胞表面。以該重組病毒作為CyHV?2疫苗對異育銀鯽進行浸泡免疫，攻毒試驗表明該重組桿狀病毒免疫可以對CyHV?2感染提供83.3％的相對保護率。

技術領域

本發(fā)明屬于病毒載體疫苗技術領域，具體地說，涉及一種展示CyHV-2膜蛋白的重組桿狀病毒及其制備方法和應用。

背景技術

CyHV-2(鯉皰疹病毒2型)是感染異育銀鯽引起皰疹病毒性造血器官壞死病的病原，春季和秋季是其致病的高發(fā)季節(jié)，死亡率可高達100％，近年來給我國的鯽魚養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。CyHV-2是雙鏈DNA病毒，基因組長達290kb，可編碼150種蛋白，其中包括36種膜蛋白(Journal of virology 2013；87:2908-2922)。

疫苗免疫是控制病毒感染的重要手段。研究表明，針對CyHV-2的感染，滅活疫苗可以為異育銀鯽提供71.4％的相對保護率(FishShellfish Immunology 2016；49:344-350)。酵母表達系統(tǒng)表達純化的CyHV-2的囊膜蛋白ORF25,ORF25C和ORF25D可以作為亞單位疫苗，為異育銀鯽提供抵抗CyHV-2感染的保護性免疫(FishShellfish Immunology 2015；47:1024-1031)。但是這些疫苗需要注射到鯽魚體內，使用不夠簡便，保護率也不理想。

桿狀病毒可以將外源蛋白通過gp64跨膜區(qū)展示在病毒顆粒表面、轉導多種動物細胞并在轉導細胞中表達所攜帶外源基因，還可以作為疫苗佐劑刺激動物免疫反應等特點，因此在動物疫苗的研究和生產(chǎn)領域有廣泛的應用。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中存在的缺陷，提供一種展示CyHV-2膜蛋白的重組桿狀病毒及其制備方法和應用，利用桿狀病毒展示外源蛋白、對異育銀鯽細胞具有轉導能力的特點，構建了一種展示CyHV-2膜蛋白的重組桿狀病毒，主要目的是為防控CyHV-2的感染提供一種簡單、經(jīng)濟、高效的疫苗。

其具體技術方案為：

一種展示CyHV-2膜蛋白的重組桿狀病毒，ORF25在桿狀病毒表面的展示通過將ORF25的胞外區(qū)與桿狀病毒AcMNPV gp64的信號肽和跨膜區(qū)進行融合表達來實現(xiàn)，以重組桿狀病毒為載體表達的ORF25融合蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:3。

一種展示CyHV-2膜蛋白的重組桿狀病毒的制備方法，包括以下步驟：a.制備CyHV-2編碼的ORF25胞外區(qū)基因片段；b.將上述基因片段克隆到表達載體，使ORF25胞外區(qū)與AcMNPV gp64的跨膜區(qū)融合表達；c.將上述表達質粒與線性化的Bacmid共轉染昆蟲細胞，獲得重組桿狀病毒。具體為：

步驟1、從感染CyHV-2的組織勻漿中提取總DNA作為模板，以SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2為引物，擴增ORF25的胞外區(qū)基因片段。

步驟2、將獲得的PCR產(chǎn)物用BamHI和EcoRI雙酶切，克隆到pQBD表達載體，獲得重組質粒pQBD-ORF25。

步驟3、用pQBD-ORF25和線性化的AcMNPV bacmid qBac-III共轉染Sf9昆蟲細胞，轉染后5天收集P0代重組病毒。繼續(xù)擴增，獲得高滴度重組病毒。

步驟4、將重組桿狀病毒稀釋至滴度為4×10³TCID₅₀/mL，將2cm大小的異育銀鯽放入其中浸浴2小時進行免疫。