[發(fā)明專(zhuān)利]基于DNA四面體的固態(tài)納米孔單分子蛋白質(zhì)檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910716246.1
• 申請(qǐng)日: 2019-08-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110231392B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-09-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉全俊;朱立博;韓笑明;周曉祥;徐穎;蘇振;張振;黃炎;陸祖宏
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 東南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N27/48
• 分類(lèi)號(hào): G01N27/48
• 代理公司: 南京蘇高專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 陳風(fēng)平

本發(fā)明公開(kāi)了一種基于DNA四面體的固態(tài)納米孔單分子蛋白質(zhì)檢測(cè)信號(hào)放大方法及其使用的DNA四面體。本發(fā)明所述的方法包括：制備具有三維空間結(jié)構(gòu)的DNA四面體：所述DNA四面體由四片核酸瓦片雜交合成，所述核酸瓦片由第一單鏈核酸、第二單鏈核酸、第三單鏈核酸雜交合成；DNA四面體與待測(cè)蛋白質(zhì)分子連接；采用固態(tài)納米孔檢測(cè)平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)；本發(fā)明克服了單分子蛋白質(zhì)在應(yīng)用納米孔傳感器檢測(cè)時(shí)過(guò)孔速度過(guò)快的缺陷，增加檢測(cè)信號(hào)的電流變化幅值，克服檢測(cè)過(guò)程中蛋白質(zhì)團(tuán)聚的發(fā)生，樣品消耗量小，檢測(cè)的靈敏度高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于固態(tài)納米孔單分子檢測(cè)方法及其使用的載體，具體涉及一種基于DNA四面體的固態(tài)納米孔單分子蛋白質(zhì)檢測(cè)信號(hào)放大方法及DNA四面體。

背景技術(shù)

在過(guò)去的二十幾年里，納米孔傳感技術(shù)由于其較高的靈敏度及其功能的多樣性已經(jīng)受到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注。納米孔傳感器的檢測(cè)原理來(lái)源于庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器。納米孔傳感器采用電阻脈沖傳感作為檢測(cè)方案，通常為在生物膜或人工合成的絕緣薄膜上存在納米尺度的孔或通道，該絕緣薄膜將電解質(zhì)溶液流體池隔離成兩個(gè)獨(dú)立的離子池，即順式腔(Cis)與反式腔(Trans)并保證薄膜上的納米尺度孔為唯一的離子通道。兩個(gè)Ag/AgCl 電極分別插入薄膜兩側(cè)的離子池中，當(dāng)一個(gè)穩(wěn)定的偏置電壓施加在兩側(cè)后，一個(gè)跨膜的穩(wěn)定離子電流將會(huì)產(chǎn)生。當(dāng)向腔室加入攜帶電荷的分析物分子后，由于靜電力作用，該分子會(huì)穿過(guò)薄膜上的納米孔通道或與孔壁作用，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)瞬時(shí)的電流阻塞現(xiàn)象，根據(jù)檢測(cè)分析的電流阻塞幅值與易位時(shí)間，能夠得到分析物分子的物理化學(xué)性質(zhì)(尺寸、形狀、攜帶電荷量等)。根據(jù)其組成材料的不同，納米孔傳感器大體上分為兩大類(lèi)：生物納米孔與固態(tài)納米孔。生物納米孔又可以稱(chēng)其為跨膜通道蛋白質(zhì)，通常將其組裝在磷脂雙分子層基底上使用。目前應(yīng)用比較廣泛的通道蛋白大體上包括：α-溶血素蛋白(α-HL)、恥垢分枝桿菌蛋白(MspA)、氣單胞菌溶素蛋白(AeL)、噬菌體phi29蛋白(Phi29)。由于其原子級(jí)精度的結(jié)構(gòu)重復(fù)性以及分子尺度的孔徑尺寸，生物納米孔通常被用作對(duì)金屬離子、小分子、DNA鏈、小蛋白質(zhì)與多肽鏈以及與基因測(cè)序相關(guān)的核苷酸序列識(shí)別等相關(guān)檢測(cè)。

盡管生物納米孔具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但是由于其孔與膜的穩(wěn)定性較差，對(duì)工作條件如pH 值，溫度，溶液離子濃度都有較高的要求，同時(shí)通道蛋白所插入的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)穩(wěn)定差，使得生物納米孔的應(yīng)用受到了極大的限制。采用固態(tài)納米孔對(duì)單分子蛋白質(zhì)檢測(cè)主要依靠對(duì)蛋白質(zhì)分子的過(guò)孔易位行為的檢測(cè)，但由于蛋白質(zhì)分子過(guò)孔速度過(guò)快的特點(diǎn)，易位信號(hào)的采集及電流變化幅值很低，同時(shí)，蛋白質(zhì)分子很容易發(fā)生團(tuán)聚，因此，在采用常規(guī)固態(tài)納米孔對(duì)其進(jìn)行傳感檢測(cè)時(shí)，很難保證為單個(gè)蛋白質(zhì)分子易位，使得應(yīng)用固態(tài)納米孔對(duì)蛋白質(zhì)的研究面臨著很大的挑戰(zhàn)。因此，提出一種具有信號(hào)放大，增加易位事件檢測(cè)率的固態(tài)納米孔單分子傳感方法很有必要，以克服當(dāng)前單分子蛋白質(zhì)納米孔傳感的不足。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明提供一種基于DNA四面體的固態(tài)納米孔單分子蛋白質(zhì)檢測(cè)信號(hào)放大方法。本發(fā)明的另一目的是提供了用于固態(tài)納米孔單分子蛋白質(zhì)檢測(cè)信號(hào)放大的載體復(fù)合物。

技術(shù)方案：本發(fā)明所述的一種基于DNA四面體的固態(tài)納米孔單分子蛋白質(zhì)檢測(cè)信號(hào)放大方法，包括以下步驟：

(1)制備具有三維空間結(jié)構(gòu)的DNA四面體：所述DNA四面體由四片核酸瓦片雜交合成；所述核酸瓦片由第一單鏈核酸、第二單鏈核酸及第三單鏈核酸雜交合成；所述第一單鏈核酸序列由78個(gè)堿基組成，所述第一單鏈核酸序列如SEQ ID NO：1，所述第二單鏈核酸序列由42個(gè)堿基組成，所述第二單鏈核酸序列如SEQ ID NO：2，所述第三單鏈核酸序列由31個(gè)堿基組成，所述第三單鏈核酸序列的5’末端修飾有一個(gè)羧基基團(tuán)，所述第三單鏈核酸序列如SEQ ID NO：3；

(2)DNA四面體與待測(cè)蛋白質(zhì)分子連接：將步驟(1)中制備的DNA四面體與 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺混合，加入所述待測(cè)蛋白質(zhì)分子，形成DNA四面體與蛋白質(zhì)復(fù)合物；