[發明專利]一種毛竹筍高活性線粒體的提取純化及鑒定方法

有效

• 申請號: 201910707028.1
• 申請日: 2019-08-01
• 公開（公告）號: CN110438062B
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 盧存福;王曉靜;崔洪瑋;耿新;楊穎;于婷喬;陳玉珍
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 白艷

本發明公開了一種毛竹筍高活性線粒體的提取純化及鑒定方法。本發明提供了一種提取毛竹筍線粒體的方法，包括如下步驟：將毛竹筍依次進行勻漿、差速離心和蔗糖密度梯度離心，即得到純化線粒體；所述差速離心采用離心力依次為1300?1700g、5000?7000g和12000?15000g。本發明的方法對線粒體的損傷小，提取的線粒體活性高，對線粒體以外的細胞核組分、葉綠體或前質體組分、酚類和多糖等分離較為徹底，且從純化的線粒體中可提取到高質量的線粒體RNA，這對后續的分子生物學實驗，如PCR反應、cDNA文庫構建、線粒體轉錄組研究等奠定了良好的基礎。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種毛竹筍高活性線粒體的提取純化及鑒定方法。

背景技術

毛竹是我國種植面積最廣的竹種，因生長速度快，產量高，力學性能好而深受青睞。毛竹筍是毛竹的幼體，竹筍生長是毛竹生長的初始階段，也是毛竹速生成材的重要基礎。毛竹筍在冬季處于休眠階段，筍體不大，埋于土中，立春以后迅速長大，破土而出，其大小、顏色等形態特征發生了明顯改變。毛竹筍的這一快速生長變化過程需要大量的能量支持，而線粒體作為植物體內能量代謝的重要細胞器及胞內ATP產生的主要場所，在此過程中無疑承擔著關鍵性的作用。因此，提取高活性、高純度的毛竹筍線粒體，對研究毛竹筍打破休眠，啟動快速生長的能量代謝調控機制至關重要。

目前，對線粒體提取及相關呼吸代謝、能量代謝的研究多集中在人和動物組織細胞中，對植物材料的研究較少。而且從現有的研究方法中，分離得到的線粒體絕大多數為粗提取的線粒體，含有來自細胞核，葉綠體或前質體等的污染，這對后續研究帶來了很大干擾。線粒體作為植物細胞內相對獨立的細胞器，包含自身特有的基因組及遺傳信息。因此，分離純化并鑒定高活性、高純度的線粒體，對線粒體RNA的提取，cDNA文庫的構建及從轉錄水平研究線粒體能量代謝機制是十分必要的，而現階段針對毛竹筍高活性線粒體提取純化及鑒定的方法還未有報道。

發明內容

為了提高一種毛竹筍高活性高純度線粒體的提取純化方法，本發明提供如下技術方案：

本發明一個目的是提供一種提取毛竹筍線粒體的方法。

本發明提供的方法，包括如下步驟：將毛竹筍依次進行勻漿、差速離心和蔗糖密度梯度離心，即得到純化線粒體；

所述差速離心采用離心力依次為1300-1700g、5000-7000g和12000-15000g。

上述方法中，所述差速離心包括如下步驟：

1)將過濾后濾液先1300-1700g離心5-15min，收集上清液；

2)再將所述步驟1)收集的上清液5000-7000g離心10-15min，收集上清液；

3)再將所述步驟2)收集的上清液12000-15000g離心10-15min，收集沉淀，得到粗提線粒體。

上述勻漿為將毛竹筍與研磨緩沖液混合(按照每200mL研磨緩沖液150g樣品的比例)，避光置于4℃冰箱過夜，再進行勻漿，得到漿液；

上述勻漿條件為轉速18000r/min，時間為2min，期間每開機5s暫停3s。

其中，研磨緩沖液配方：1.25M NaCl，0.3M蔗糖，50mM Tris-HCl，5mM EDTA，2mMEGTA，0.5％PVP-40，0.5％BSA，15mMβ-巰基乙醇，PH調至8.0。

上述方法中，所述差速離心包括如下步驟：

1)將過濾后濾液先1500g離心5-15min，收集上清液；

2)再將所述步驟1)收集的上清液6000g離心10-15min，收集上清液；