[發(fā)明專利]一種毛竹筍高活性線粒體的提取純化及鑒定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910707028.1
• 申請日: 2019-08-01
• 公開（公告）號: CN110438062B
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發(fā)明（設計）人: 盧存福;王曉靜;崔洪瑋;耿新;楊穎;于婷喬;陳玉珍
• 申請（專利權）人: 北京林業(yè)大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權代理有限公司 11245
• 代理人: 白艷

1.一種提取毛竹筍線粒體的方法，包括如下步驟：將毛竹筍依次進行勻漿、差速離心和蔗糖密度梯度離心，即得到純化線粒體；

所述差速離心包括如下步驟：

1）將過濾后濾液先1500 g離心5-15 min，收集上清液；

2）再將所述步驟1）收集的上清液6000 g離心10-15 min，收集上清液；

3）再將所述步驟2）收集的上清液15000 g離心10-15 min，收集沉淀，得到粗提線粒體；

所述蔗糖密度梯度離心后還包括如下步驟：將所述蔗糖密度梯度離心收集的純化后分層的線粒體經(jīng)18,000 g離心15-25 min，收集沉淀，獲得純化線粒體；

所述蔗糖密度梯度離心包括如下步驟：將所述粗提線粒體懸浮，得到粗提線粒體懸浮液；再向離心管中依次加入質量體積百分含量40%蔗糖溶液、質量體積百分含量23% 蔗糖溶液和所述粗提線粒體懸浮液進行蔗糖密度梯度離心，收集處于23% 蔗糖溶液上下分界層的溶液，得到純化后分層的線粒體；

所述蔗糖密度梯度離心的條件為：20,000 g離心40-50 min。

2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：

所述步驟1）和所述步驟2）均重復2-3次；

在所述勻漿和所述差速離心之間還包括將所述勻漿的產(chǎn)物過濾，收集濾液的步驟。

3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述離心均為低溫離心。

4.一種制備具有活性且純化高的毛竹筍線粒體的方法，包括如下步驟：

1）權利要求1-3任一所述方法，得到純化線粒體；

2）將所述純化線粒體通過線粒體染色鑒定和線粒體特征基因擴增鑒定，線粒體染色顯色且僅含有線粒體特征atp8基因且不含有毛竹核基因和毛竹葉綠體基因的線粒體，為具有活性且純度高的線粒體。

5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于：

所述線粒體染色鑒定為用詹納斯綠B法或羅丹明123法對所述純化線粒體染色，選取線粒體染色顯色的線粒體；

所述線粒體特征基因擴增鑒定為用擴增線粒體特征atp8基因的引物、擴增毛竹核基因actin的引物和擴增毛竹葉綠體基因spbB的引物分別對所述純化線粒體進行PCR擴增，選取僅含有線粒體特征atp8基因且不含有毛竹核基因和毛竹葉綠體基因的線粒體。

6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于：

所述詹納斯綠B法采用詹納斯綠B染液染色，所述染色條件為常溫染色25-35min；

所述羅丹明123法采用羅丹明123染液染色，所述染色條件為30 ℃避光染色4-6 min；

所述擴增線粒體特征atp8基因的引物由SEQ ID NO.1所示的單鏈DNA分子和SEQ IDNO.2所示的單鏈DNA分子組成；

所述擴增毛竹核基因actin的引物由SEQ ID NO.3所示的單鏈DNA分子和SEQ ID NO.4所示的單鏈DNA分子組成；

所述擴增毛竹葉綠體基因spbB的引物由SEQ ID NO.5所示的單鏈DNA分子和SEQ IDNO.6所示的單鏈DNA分子組成。

7.權利要求1-3任一所述方法在制備具有活性且純化高的毛竹筍線粒體中的應用。