[發明專利]一種提高轉基因細胞重組效率的組合物及方法

有效

• 申請號: 201910705696.0
• 申請日: 2019-08-01
• 公開（公告）號: CN110551759B
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發明（設計）人: 黎肖容
• 申請（專利權）人: 廣州賽業百沐生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/89;A01K67/027
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝

本發明公開了一種提高轉基因細胞重組效率的組合物及方法，通過使用含有SCR7、RS?1或L755507的培養基處理轉基因后的細胞，提高了轉基因細胞的HDR效率。本發明的一些實例，通過使用特定的sgRNA組合，獲得了更高的轉基因效率，解決了二次注射會導致受精卵受損較為嚴重，出生率會下降比較嚴重而導致陽性繁殖數量不足的缺陷。

技術領域

本發明涉及轉基因領域，具體涉及一種提高轉基因細胞重組效率的組合物及方法。

背景技術

動物模型，特別是轉基因鼠模型，是進行各項生命科學研究的一個重要工具，應用范圍廣泛。

在眾多的轉基因動物中，點突變鼠由于其易于培養，成本相對較低，是常見的轉基因動物模型。現有技術制備點突變鼠主要有3種方案：

一是傳統ES打靶的方案，其缺點是：(1)需要復雜的打靶載體構建、ES細胞篩選、嵌合體小鼠選育等一系列步驟，不僅流程繁瑣、對技術的要求很高，而且費用大、耗時較長，且效率低；(2)不同品系的鼠需要不同的ES細胞，目前ES打靶做得比較多的都是常見的C57BL/6品系，其他的品系沒看到有相關的報道。例如，點突變模型主要用于研究人類疾病，其經常需要用到特殊的品系，由于沒有相關的ES細胞，所以無法采用ES打靶這項技術進行制備。

二是TALEN方案：其缺點是：(1)設計識別20個堿基序列的TALEN蛋白含有一千多個氨基酸，因而可能會引起機體的免疫反應，這將降低TALEN在細胞中的作用；(2)TALEN也存在脫靶的問題，這可能由于細胞中染色體的狀態引起的，如TALEN技術對于處于異染色體結構中的基因序列沒有效果；(3)TALEN技術是否可以勝任摻入大的片段？目前TALEN技術的應用主要集中在基因敲除方面，但是否適合大片段的基因插入還需進一步研究。最重要的是，目前較先進的ZFN/TALEN技術基于能特異性識別堿基核苷酸來構建基因打靶載體，但打靶載體的構建非常復雜，制備時間長，產生的細胞毒性大，且都不能真正做到同時完成基因組多位點的敲除。

三是CRISPR/Cas9方案。CRISPR/Cas9的方案包括兩種，一種是野生型的hCas9,另一種是突變型的Cas9_D10A。野生型的hCas9的缺點：(1)容易造成脫靶效應；(2)對于一些重要基因的重要突變點容易造成致死。突變型的Cas9_D10A的缺點：兩種不同的sgRNA對靶位點兩側序列分別進行識別，然后結合單切口Cas9核酸酶，對兩條鏈分別進行剪切，從而提高了靶位點識別特異性，減少了脫靶效應,但由于單切口Cas9核酸酶效率比較低，導致 Cas9_D10A方案的陽性率比較低。

CRISPR/Cas9技術的基因編輯機制：CRISPR/Cas9通過對預設的DNA位點進行切割，造成DNA雙鏈斷裂(DSB,double strand break)。這種DNA的損傷可以啟動細胞內的修復機制，主要包括兩種途徑：一是低保真性的非同源末端連接途徑(NHEJ，Non-homologous endjoining)，此修復機制非常容易發生錯誤，導致修復后發生堿基的缺失或插入(Indel)，從而造成移碼突變，最終達到基因敲除的目的。NHEJ是細胞內主要的DNA斷裂損傷修復機制。利用靶向核酸酶可以在受精卵水平高效的實現移碼突變，從而制備基因敲除模式動物。CRISPR/Cas9技術的出現，使得無需再使用相應物種的ES細胞系就可以制備基因敲除模式生物，且已成功應用于小鼠、大鼠、豬、靈長類、果蠅等等。第二種DNA斷裂修復途徑為同源介導的修復(HR,homology-directed repair)，這種基于同源重組的修復機制保真性高，但是發生概率低。在提供外源修復模板的情況下，靶向核酸酶對DNA的切割可以將同源重組發生的概率提高約1000倍。利用這種機制可以實現基因組的精確編輯，如：條件性基因敲除、基因敲進、基因替換、點突變等等。