[發(fā)明專利]一種提高轉(zhuǎn)基因細胞重組效率的組合物及方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910705696.0
• 申請日: 2019-08-01
• 公開（公告）號: CN110551759B
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黎肖容
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州賽業(yè)百沐生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/89;A01K67/027
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝

1.一種利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)制備點突變動物的方法，包括：

1)將Cas9-D10A mRNA和Donor oligo的混合物直接注入單細胞受精卵的一細胞的胞漿內(nèi)；

2)待受精卵發(fā)育成二細胞，把預(yù)混好的sgRNA混合物直接注入二細胞中；

3)注射后將二細胞期的受精卵放置在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)；

4)將培養(yǎng)后的細胞移植到雌體內(nèi)，產(chǎn)仔后得到點突變動物；

其中，培養(yǎng)基為添加有SCR7的KSOM培養(yǎng)基，SCR7在KSOM培養(yǎng)基中的終濃度為1.5～4.5μM；

所述的點突變動物為Fars2基因點突變鼠，突變點為D142Y；所述Donor oligo的序列為AGTGGTCACCACCTGGCAGAACTTCGATAGCCTGCTAATCCCAGCTGACCACCCCAGCAGGAAGAAGGGGTACAACTATTACTTGAATCGGGGACACATGCTGAGAGCACACACATCAGCACATCAGTGGGACTTGCTGCATG；

所述sgRNA的序列為：

sgRNA1：

Pair1-g1-F：caccgTTGTCCCCCTTCTTCCTGCT

Pair1-g1-R：aaacAGCAGGAAGAAGGGGGACAAc

和sgRNA2：

Pair1-g2-F：caccgGGACAACTATTACTTGAATC

Pair1-g2-R：aaacGATTCAAGTAATAGTTGTCCc；

所述方法不用于疾病的診斷和治療。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述突變點為GAC＞TAC的單核苷酸突變。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述Cas9-D10A mRNA和Donor oligo的混合物中，Cas9-D10A mRNA和Donor oligo的終濃度均為40ng/μL～120ng/μL。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述Cas9-D10A mRNA和Donor oligo的質(zhì)量比為1：1。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述sgRNA混合物中，sgRNA1和sgRNA2的終濃度均為20ng/μL～60ng/μL。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述sgRNA1和sgRNA2的質(zhì)量比為1：1。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：將二細胞期的受精卵放置在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的時間為12～48小時。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述時間為24小時。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述動物為大鼠SD、LongEvans、Wistar、F344；小鼠C57BL/6N、C57BL/6J、FVB。