[發明專利]致病性念珠菌檢測和鑒定方法

有效

• 申請號: 201910700999.3
• 申請日: 2019-07-31
• 公開（公告）號: CN110244049B
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發明（設計）人: 趙煥朝;陳興;栗克文;郭凱;胡晶潔
• 申請（專利權）人: 河南美凱生物科技有限公司;石家莊和亞生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/558;G01N21/78
• 代理公司: 鄭州博派知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 41137
• 代理人: 榮永輝

本發明提供了一種致病性念珠菌檢測和鑒定方法，具體為：以致病性念珠菌分泌的特異性烯醇化酶作為檢測靶標分子，采用基因工程和細胞工程技術生產念珠菌特異性烯醇化酶的單克隆抗體、標記物和包被載體，通過雙抗體夾心法對致病性念珠菌進行檢測和鑒定。本發明還提供了致病性念珠菌檢測和鑒定卡及其制備方法。本發明首次實現了對致病性念珠菌分離鑒定，采用白色念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌烯醇化酶的通用抗體作為標記物，使4種細菌能在同一檢測和鑒定卡上檢測出來，省去依次單一盲測確定何種菌株的感染的麻煩，方便經濟。

技術領域

本發明涉及體外診斷技術領域，具體涉及致病性念珠菌檢測和鑒定方法。

背景技術

念珠菌呈卵圓形，革蘭染色陽性，是一種多形態的真菌，是人體最常見的寄生真菌，通常存在于正常人口腔、呼吸道、腸道及陰道，是常見的條件致病菌。常見致病性念珠菌為白色念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌，其中白色念珠菌約占80％～90％，熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌共占10％～20％。現階段，體外診斷行業念珠菌的檢測和鑒定主要依靠樣本培養，而血液感染主要依靠血培養但檢測率不足50％，有報道用檢測試紙檢測念珠菌的，但并不能對念珠菌進行鑒定，也未見有商品生產。由于人體寄生有多種類非致病性念珠菌，整體檢測念珠菌會因非致病性念珠菌的干擾，造成假陽性診斷。

不同的致病念珠菌對抗真菌的敏感性不同，不鑒定時只能靠抗生素盲目治療，耽誤病情，現階段念珠菌鑒定仍然依靠念珠菌顯色平板培養，這種方法培養時間長，操作麻煩，導致臨床上常難以早期診斷。因此迫切需要一種快速、敏感、高效的方法來進行輔助診斷。

烯醇化酶又稱2-磷酸-D-甘油酸水解酶，是一個表達在念珠菌表面且具有極高的免疫原性的分子。烯醇化酶編碼基因及蛋白結構具有高度保守性，念珠菌與其它幾種酵母菌的相似性在90％以上。因此檢測烯醇化酶可用來診斷致病性念珠菌，并將白色念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌予以區分。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服念珠菌培養法檢測鑒定耗時長，易污染之技術缺陷，提供一種念珠菌烯醇化酶的檢測和鑒定方法，利用念珠菌烯醇化酶的特異性單克隆抗體，能夠及時準確地判斷待測樣本中是否含有念珠菌烯醇化酶進而間接判斷是否有念珠菌感染，并對常見的四種致病性念珠菌進行鑒別及定量分析。

本發明提供了一種致病性念珠菌檢測和鑒定方法。具體技術方案如下：

一種致病性念珠菌檢測和鑒定方法，具體為：以致病性念珠菌分泌的特異性烯醇化酶作為檢測靶標分子，采用基因工程和細胞工程技術生產念珠菌特異性烯醇化酶的單克隆抗體、標記物和包被載體，通過雙抗體夾心法對致病性念珠菌進行檢測和鑒定。

進一步地，所述致病性念珠菌包括白色念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌。

進一步地，所述念珠菌特異性烯醇化酶的單克隆抗體中白色念珠菌分泌的特異性烯醇化酶對應特異性單克隆抗體A，熱帶念珠菌分泌的特異性烯醇化酶對應特異性單克隆抗體B，近平滑念珠菌分泌的特異性烯醇化酶對應特異性單克隆抗體C，光滑念珠菌分泌的特異性烯醇化酶對應特異性單克隆抗體D，專一的單克隆抗體與其它烯醇化酶無交叉反應；所述白色念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌分泌的特異性烯醇化酶都對應特異性單克隆抗體E。

一種致病性念珠菌檢測和鑒定卡，包括卡殼和試紙條，卡殼分為上下兩片，用于固定試紙條，上片有鏤空的觀察窗和加樣孔，所述加樣孔內側用無紡布覆蓋粘接；試紙條包括樣本處理墊、標記物墊、硝酸纖維素膜和吸水紙。

進一步地，所述試紙條樣本墊為玻璃纖維紙，用PBST-EDTA緩沖液浸潤后烘干得到。

進一步地，所述試紙條標記物墊，使用標記物標記單克隆抗體E，均勻噴涂在硝酸纖維素膜上，烘干得到；所述標記物包括但不局限于膠體金、過氧化物酶、吖啶酯、堿性磷酸酶、乳膠微球或熒光物質。