[發明專利]致病性念珠菌檢測和鑒定方法

有效

• 申請號: 201910700999.3
• 申請日: 2019-07-31
• 公開（公告）號: CN110244049B
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發明（設計）人: 趙煥朝;陳興;栗克文;郭凱;胡晶潔
• 申請（專利權）人: 河南美凱生物科技有限公司;石家莊和亞生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/558;G01N21/78
• 代理公司: 鄭州博派知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 41137
• 代理人: 榮永輝

1.一種致病性念珠菌檢測和鑒定方法，其特征在于，以致病性念珠菌分泌的特異性烯醇化酶作為檢測靶標分子，采用基因工程和細胞工程技術生產念珠菌特異性烯醇化酶的單克隆抗體、標記物和包被載體，通過雙抗體夾心法對致病性念珠菌進行檢測和鑒定，所述致病性念珠菌包括白色念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌，所述念珠菌特異性烯醇化酶的單克隆抗體中白色念珠菌分泌的特異性烯醇化酶對應特異性單克隆抗體A，熱帶念珠菌分泌的特異性烯醇化酶對應特異性單克隆抗體B，近平滑念珠菌分泌的特異性烯醇化酶對應特異性單克隆抗體C，光滑念珠菌分泌的特異性烯醇化酶對應特異性單克隆抗體D，專一的單克隆抗體與其它烯醇化酶無交叉反應；所述白色念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌分泌的特異性烯醇化酶都對應特異性單克隆抗體E。

2.一種根據權利要求1所述致病性念珠菌檢測和鑒定方法的致病性念珠菌檢測和鑒定卡，其特征在于，包括卡殼和試紙條，卡殼分為上下兩片，用于固定試紙條，上片有鏤空的觀察窗和加樣孔，所述加樣孔內側用無紡布濾布覆蓋粘接；試紙條包括樣本處理墊、標記物墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，試紙條標記物墊使用標記物標記單克隆抗體E，均勻噴涂在硝酸纖維素膜上；所述標記物包括但不局限于膠體金、過氧化物酶、吖啶酯、堿性磷酸酶、乳膠微球或熒光物質；硝酸纖維素膜上分別包被單克隆抗體A、B、C、D和羊抗鼠質控抗體；硝酸纖維素膜上待包被抗體加入與標記抗體顏色不同的色素，使包被過硝酸纖維素膜上的條線清晰易見。

3.根據權利要求2所述的致病性念珠菌檢測和鑒定卡，其特征在于，樣本處理墊為玻璃纖維紙，用PBST-EDTA緩沖液浸潤后烘干得到。

4.根據權利要求2所述的致病性念珠菌檢測和鑒定卡，其特征在于，所述無紡布濾布目數為100～300。

5.一種根據權利要求2~4任一所述的致病性念珠菌檢測和鑒定卡的制備方法，其特征在于，具體步驟如下：

步驟一、將標記物標記的單克隆抗體E分別用含30%BSA的PBS緩沖液稀釋濃度為0.1～1mg/mL制成標記液，噴到玻璃纖維紙上作為標記物墊；

步驟二、將單克隆抗體A、B、C和D分別用含30%BSA的PBS緩沖液稀釋濃度為0.1～1 mg/mL制成包被液，并分別加入0.1 mg/mL的日落黃，按順序用劃膜儀依次從左至右包被到硝酸纖維素膜作為4條檢測線；將羊抗鼠抗體用同樣的PBS緩沖液稀釋至1mg/mL，并加入0.1 mg/mL的日落黃，用劃膜儀包被到D線右側的硝酸纖維素膜上作為質控線，干燥后硝酸纖維素膜上會有5條淺黃色的條帶；

步驟三、將玻璃纖維紙用0.01～0.1 mol/mL pH=7.2的PBST-EDTA緩沖液浸潤，浸潤后的玻璃纖維紙使用恒溫鼓風干燥箱烘干，作為樣本處理墊；

步驟四、試紙條組裝，依次將樣本處理墊、標記物墊、硝酸纖維素膜和吸水紙組裝到PVC底板上再切條即可；

步驟五、在卡殼上蓋，加樣孔內側用防水快干膠粘上一層無紡布濾布，無紡布能夠完全覆蓋加樣孔；

步驟六、將試紙條放入卡殼，加樣孔對準樣本處理墊，觀察窗對準試紙條上硝酸纖維素膜，把上下卡殼壓緊即可。