[發(fā)明專利]一種聯(lián)合檢測(cè)EGFR基因突變的試劑盒及方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910700056.0
• 申請(qǐng)日: 2019-07-31
• 公開（公告）號(hào): CN110373454A
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭興中
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州丹威生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6858
• 分類號(hào): C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧

本發(fā)明公開了一種聯(lián)合檢測(cè)人類EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒，本發(fā)明包括的引物和探針包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:32；可以對(duì)EGFR1基因上T790M、L858R、19del、G719X，S768I和L861Q突變進(jìn)行檢測(cè)，可以在一個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)檢測(cè)出多種突變；靈敏度較高，可以檢測(cè)出3?10拷貝數(shù)；高特異性，10ng/ul野生型質(zhì)粒不會(huì)產(chǎn)生非特異性信號(hào)；檢測(cè)快速高效，操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低廉。

本申請(qǐng)主張中國在先申請(qǐng)，申請(qǐng)?zhí)?01910238686.0申請(qǐng)日：2019年3月27日的優(yōu)先權(quán)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及基于熒光探針和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒及方法。

背景技術(shù)

目前，肺癌已成為全球癌癥死亡的首要原因，全球每年新發(fā)病例150萬，嚴(yán)重威脅人類健康。在肺癌患者中，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占85％，且就診時(shí)80％已失去手術(shù)或放射治療最佳機(jī)會(huì)，致使其長(zhǎng)期生存率低，療效令人堪憂。ⅢB/Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌2年生存率僅10.20％，中位生存時(shí)間僅10-12月。因此，人們需要不斷研究新的治療方法以提高肺癌治療的有效率，其中以分子靶向治療為代表的新治療方法，為晚期NSCLC的治療帶來了新的希望和曙光。

表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是目前NSCLC治療最重要的分子靶點(diǎn)，其是原癌基因C-erbB-1(HER-1)的表達(dá)產(chǎn)物，基因定位于第7號(hào)染色體短臂(7p12)，全長(zhǎng)200Kb，由28個(gè)外顯子組成。C-ErbB-1的編碼產(chǎn)物EGFR為含有1210個(gè)氨基酸殘基的單一多肽鏈前體，其中24個(gè)氨基酸為信號(hào)肽段，在翻譯加工時(shí)被裂解，故成熟的EGFR是由1186個(gè)氨基酸組成的酪氨酸蛋白激酶，分子量約為170KDa。肺腺癌患者EGFR基因敏感性突變陽性率在亞裔人群和我國均為50％左右。隨著對(duì)非小細(xì)胞肺癌發(fā)病機(jī)制進(jìn)一步的研究以及對(duì)其分子生物學(xué)行為的深入探討，有針對(duì)性的分子藥物靶向治療成為治療晚期非小細(xì)胞肺癌很有前景的治療方式。表皮生長(zhǎng)因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(epidermalgrowth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)包括厄洛替尼(erlotinib)和吉非替尼(gefitinib)等，在治療晚期NSCLC方面發(fā)揮了很重要的作用，效果顯著，現(xiàn)已成為一線藥物，為患者的治療帶來的很大的希望，廣泛受到大家的認(rèn)可。EGFR-TKIs在改善晚期非小細(xì)胞肺癌患者總生存期和無進(jìn)展生存期方面有很顯著的作用，然而，經(jīng)過一段時(shí)間的臨床治療后，發(fā)現(xiàn)有一大部分患者會(huì)對(duì)EGFR-TKIs產(chǎn)生耐藥性，大大限制了臨床的應(yīng)用，所以進(jìn)一步分析研EGFR表達(dá)于正常上皮細(xì)胞表面，而在一些腫瘤細(xì)胞中經(jīng)常過表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵潤(rùn)、預(yù)后差有關(guān)。EGFR常發(fā)生突變，其酪氨酸激酶區(qū)域的突變主要發(fā)生在18-21號(hào)外顯子，在中國肺癌患者中，EGFR突變率占30-50％，其中19和21號(hào)(L858R,L861I)外顯子突變率占總突變率的90％左右，18號(hào)外顯子突變占總突變率的5％左右，20號(hào)外顯子上T790M突變占突變率的5％左右。

目前EGFR基因突變的檢測(cè)方法主要包括以下幾種：

(1)Sanger測(cè)序法是根據(jù)核苷酸在某一固定的點(diǎn)開始，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止，并且在每個(gè)堿基后面進(jìn)行熒光標(biāo)記，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長(zhǎng)度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得可見DNA堿基序列的一種方法。測(cè)序的過程檢測(cè)周期較長(zhǎng)且較繁瑣，消費(fèi)昂貴，通量不高，靈敏度較小，只能檢測(cè)突變比例在10％-20％以上的基因突變，因此不適用于臨床上大量樣本的分析與研究。