[發明專利]一種聯合檢測EGFR基因突變的試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201910700056.0
• 申請日: 2019-07-31
• 公開（公告）號: CN110373454A
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發明（設計）人: 郭興中
• 申請（專利權）人: 杭州丹威生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧

1.一種聯合檢測人類EGFR基因突變檢測試劑盒，其特征在于，包括TaqMan探針，PNA探針，阻斷劑Blocker，引物對，陽性質控和陰性質控。

2.如權利要求1所述的TaqMan探針，其特征在于，其探針序列為SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20的至少15個連續核苷酸。探針5’端被熒光報告基團FAM和VIC等修飾，3’端被熒光淬滅基團MGB，BHQ1等修飾。

3.如權利要求1所述的PNA探針，其特征在于，其探針序列為SEQ ID NO:10的至少15個連續核苷酸，探針無任何修飾，與包含突變位點野生型EGFR序列完全互補配對。

4.如權利要求1所述的21外顯子阻斷劑Blocker，其特征在于，其序列為SEQ ID NO:11的至少15個連續核苷酸。

5.如權利要求1所述的引物對具體包括：

(1)針對20號外顯子T790M替代突變的引物對序列分別包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的至少連續15個核苷酸；

(2)針對21號外顯子L858R替代突變的引物對序列分別包括SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的至少連續15個核苷酸；

(3)針對19號外顯子缺失的引物對序列分別包括SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的至少連續15個核苷酸；

(4)針對G719X，S768I，L861Q罕見突變的引物對序列分別包括SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19的至少連續15個核苷酸。

6.如權利要求1所述的陽性質控和陰性質控，其特征在于，陽性質控其序列分別是SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32。

7.一種聯合檢測人類EGFR基因突變檢測的方法，其特征在于，包括以下幾個方面：

(1)獲得EGFR野生型和突變型細胞株核酸樣本，作為PCR模板，構建相應的載體質粒，作為陰性質控品和陽性質控品；

(2)如權利要求2，3，4和5所述，TaqMan探針，PNA探針，阻斷劑Blocker,引物對，陽性質控和陰性質控，按照25ul Q-PCR反應體系混勻，進行實時熒光定量PCR反應。EGFR突變樣本和野生型樣本按1/1，1/10，1/100，1/1000，1/10000比例稀釋混勻，繪制標準曲線圖；

(3)獲得醫院非小細胞肺癌患者組織標本，用磁珠法提取核酸樣本，進行熒光定量PCR反應，根據標準曲線系數，獲得患者EGFR基因突變量。