[發明專利]一種原代肝細胞凍存液、肝細胞凍存的方法及肝細胞復蘇的方法

有效

• 申請號: 201910698345.1
• 申請日: 2019-07-31
• 公開（公告）號: CN110463689B
• 公開（公告）日: 2022-12-30
• 發明（設計）人: 周明
• 申請（專利權）人: 周明
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C12N5/071
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 解麗麗

本發明公開了一種原代肝細胞凍存液、肝細胞凍存的方法及肝細胞復蘇的方法，屬于原代肝細胞凍存與復蘇領域。所述原代肝細胞凍存液，由如下體積百分數的組分組成：45％溶液A、10％?45％胎牛血清、10％二甲基亞砜和0％?35％水，所述溶液A由如下組分組成：D?葡萄糖、羥乙基淀粉、乳糖酸、聚乙烯吡咯烷酮、五水D?棉子糖、氫氧化鉀、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、腺苷、還原性谷胱甘肽、別嘌醇、牛磺熊去氧膽酸和甘草酸二氨。本發明還公開了一種肝細胞凍存的方法及肝細胞復蘇的方法。本發明的原代肝細胞凍存液可以降低原代肝細胞在凍存過程中的損傷、提高解凍后原代肝細胞活力與貼壁效率，可廣泛用于肝臟基礎研究與新藥研發過程中。

技術領域

本發明涉及一種原代肝細胞凍存液、肝細胞凍存的方法及肝細胞復蘇的方法，屬于肝細胞凍存與復蘇技術領域。

背景技術

原代肝細胞是指從肝組織取出后立即培養的肝細胞，可廣泛用于基礎研究與藥物研發，包括肝臟研究、肝炎病毒研究，藥物代謝及毒性研究。然而，分離的原代肝細胞長期保存難、個體差異大、運輸困難等局限性限制了其廣泛應用。凍存可以在較大程度上解決長期保存難、個體差異大、運輸困難等局限性。

目前，原代肝細胞凍存液及相應肝細胞的凍存與復蘇方法有兩種，具體如下：

第一種，傳統的癌細胞凍存液，是在DMEM培養基中加入45％v/v的FBS和10％v/v的二甲基亞砜(DMSO)。凍存方法為程序降溫盒于-80℃放置至少3h，最后轉移到液氮中長期保存。復蘇方法是置于37℃水浴鍋中迅速解凍細胞，然后經過離心，去掉上清，利用鋪板培養基重懸細胞即可。該凍存液在凍存癌細胞上具有優異的效果，但對原代肝細胞的凍存效果很差，存在細胞活力低、細胞難以貼壁的情況。因此，該凍存液及復蘇方法并不適用于原代肝細胞的凍存與復蘇。

第二種，CryoStorCS10凍存液，生產廠家為BioLifeSolutions，具體成分不詳，因為生產廠家未公開，但價格昂貴，目前市場售價為3500人民幣/100mL。凍存與復蘇方法按該凍存液的說明書進行。采用該凍存液凍存的肝細胞，復蘇后細胞活力高，但出現細胞不貼壁的幾率非常大。因此，采用該凍存液凍存的肝細胞，僅可用于藥物代謝研究。而藥物毒性、藥物誘導、肝臟基礎研究等研究均需要用到貼壁的原代肝細胞。因此，該凍存液具有嚴重的局限性。

鑒于此，有必要提供一種新的、高效的原代肝細胞凍存液及利用其進行肝細胞凍存與復蘇的方法，以解決現有技術的不足。

發明內容

本發明的目的之一，提供一種原代肝細胞凍存液。本發明的原代肝細胞凍存液，具有維持肝細胞正常滲透壓、保護肝細胞膜、降低凍存與復蘇對肝細胞活力與貼壁能力的影響等優點。相比于現有技術的癌細胞凍存液和CryoStorCS10凍存液，采用本發明的原代肝細胞凍存液可顯著提升復蘇后原代肝細胞的活力與貼壁能力。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：一種原代肝細胞凍存液，由如下體積百分數的組分組成：45％的溶液A、10％-45％的胎牛血清、10％的二甲基亞砜和0％-35％的水，其中，所述溶液A由如下組分組成：100mg/mL-140mg/mL的D-葡萄糖、90mg/mL-130mg/mL羥乙基淀粉、70mg/mL-90mg/mL乳糖酸、40mg/mL-60mg/mL聚乙烯吡咯烷酮、30mg/mL-50mg/mL五水D-棉子糖、10mg/mL-15mg/mL氫氧化鉀、6mg/mL-9mg/mL磷酸二氫鉀、2mg/mL-4mg/mL七水硫酸鎂、2mg/mL-4mg/mL腺苷、1mg/mL-3mg/mL還原性谷胱甘肽、0.2mg/mL-0.4mg/mL別嘌醇、5×10^-3mg/mL-7×10^-3mg/mL牛磺熊去氧膽酸和1×10^-3mg/mL-10mg/mL甘草酸二氨，調pH值至7.4,4℃保存。

本發明的各個原料介紹：

1、D-葡萄糖