[發明專利]一種原代肝細胞凍存液、肝細胞凍存的方法及肝細胞復蘇的方法

有效

• 申請號: 201910698345.1
• 申請日: 2019-07-31
• 公開（公告）號: CN110463689B
• 公開（公告）日: 2022-12-30
• 發明（設計）人: 周明
• 申請（專利權）人: 周明
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C12N5/071
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 解麗麗

1.一種原代肝細胞凍存液，其特征在于，由如下體積百分數的組分組成：45%的溶液A、45%的胎牛血清和10%的二甲基亞砜，其中，所述溶液A由如下組分組成：120mg/mL的D-葡萄糖、111mg/mL羥乙基淀粉、79.6mg/mL乳糖酸、51mg/mL聚乙烯吡咯烷酮、39.6mg/mL五水D-棉子糖、12.5mg/mL氫氧化鉀、7.56mg/mL磷酸二氫鉀、2.73mg/mL七水硫酸鎂、2.98mg/mL腺苷、2mg/mL還原性谷胱甘肽、0.3mg/mL別嘌醇、6×10^-3mg/mL?；切苋パ跄懰岷?mg/mL甘草酸二氨，調pH值至7.4,4℃保存。

2.一種肝細胞凍存的方法，其特征在于，包括：向經過常規處理后的肝細胞中加入權利要求1所述的原代肝細胞凍存液，混勻后凍存。

3.根據權利要求2所述的肝細胞凍存的方法，其特征在于，向經過常規處理后的肝細胞中加入冰浴的權利要求1所述的原代肝細胞凍存液，至凍存液中的細胞濃度為0.1×10⁷個活細胞/mL-1×10⁷個活細胞/mL,充分混勻，分裝到凍存管中,放于程序降溫盒中并于-80℃放置至少3h，最后轉移到液氮中長期保存。

4.根據權利要求2或3所述的肝細胞凍存的方法，其特征在于，所述常規處理后的肝細胞由如下方法制備得到：

步驟1：兩步膠原酶灌注法分離原代肝細胞

取新鮮的肝組織，用灌注溶液I灌注10min-30min，直至沖洗干凈肝組織中的血液，然后再用37℃預熱的灌注溶液II灌注15min-30min，直至肝組織失去彈性，得到消化好的肝組織；

步驟2：消化終止與細胞分散

將步驟1得到的消化好的肝組織轉移到含有常溫灌注溶液II的培養皿中，小心抖落消化好的細胞，形成細胞懸液并過細胞篩，得到單細胞懸液并離心；

步驟3：細胞洗液清洗

將步驟2得到的離心后的上清去掉，加入預冷的細胞洗液，巴氏吸管重懸細胞，再離心，重復本步驟2次，得到清洗好的單細胞懸液；

步驟4：細胞活力的檢測

取步驟3得到的清洗好的單細胞懸液與0.4% m/v臺盼藍染色液以體積比1:1混勻，然后檢測細胞活力，將細胞活力大于80%的單細胞懸液離心，去掉上清，即得到常規處理后的肝細胞。

5.根據權利要求4所述的肝細胞凍存的方法，其特征在于，步驟1中，所述灌注溶液I是由8.00g/L氯化鈉、0.40g/L氯化鉀、3.57g/L羥乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L二水磷酸氫二鈉 、0.06g/L磷酸二氫鉀、1g/L葡萄糖、1mM丙酮酸納和2mM乙二醇雙（2-氨基乙醚）四乙酸組成，pH值為7.4，用0.22μm微孔濾器過濾除菌，4℃保存所得；所述灌注溶液II是在威廉姆斯E培養基中添加2mM氯化鈣、15mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸和0.3g/L Ⅳ型膠原酶，pH值為7.0-7.4，用0.22μm微孔濾器過濾除菌，現用現配，37℃水浴鍋預熱60min；步驟3中，所述細胞洗液是在DMEM/F12培養基中加入1%v/v青鏈霉素和5%v/v-10%v/v胎牛血清；步驟2、步驟3和步驟5中，所述離心的重力加速度均為50g，溫度均為4℃，時間均為5min。

6.根據權利要求2或3所述的肝細胞凍存的方法，其特征在于，取凍存后的肝細胞，置于37℃水浴鍋中迅速解凍，轉移到生物安全柜中，以滴加方式加入到10倍體積的、37℃預熱的復蘇培養基中，顛倒混勻后，直接用于接種，或者再靜置30min-45min，經過離心，去掉上清，加入復蘇培養基或者等滲溶液進行重懸。

7.根據權利要求6所述的肝細胞凍存的方法，其特征在于，所述復蘇培養基由1%v/v的ITS通用型培養添加劑、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生長因子、18mg/L的氫化可的松、40μg/L的地塞米松、1%v/v的青鏈霉素、10%v/v的胎牛血清和2%m/v-4%m/v的牛血清白蛋白組成；所述等滲溶液為生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、威廉姆斯E培養基和DMEM培養基中的一種；所述離心的重力加速度為50g，溫度為4℃，時間為5min。