[發明專利]展示副溶血弧菌VP1667及VP2369蛋白的副溶血弧菌菌影疫苗制備

有效

• 申請號: 201910697119.1
• 申請日: 2019-07-30
• 公開（公告）號: CN110283770B
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 楊夢華;姬生樂;許光治
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/31;C12N15/74;C12N15/66;A61K39/106;A61P31/04;C12R1/63
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 朱欣欣

本發明涉及一種展示副溶血弧菌VP1667及VP2369蛋白的副溶血弧菌菌影疫苗制備，該菌影疫苗最終以凍干粉的形式保存，其制備過程如下：構建裂解質粒pJSL20；構建Ara和IPTG雙控誘導外膜蛋白及裂解E蛋白表達質粒pJSL24；將pJSL24通過三親結合方式轉入副溶血弧菌SD菌株中，命名為rVP；rVP表達外膜蛋白后進行裂解得rVPG，并制作凍干粉；除此之外，實驗中，以斑馬魚為模型，探究了VPG的免疫效果；實驗證明VPG有良好的安全性，并且VPG免疫的斑馬魚在一定程度上可抵御副溶血弧菌和溶藻弧菌的感染。故本發明涉及的rVPG疫苗為VPG疫苗的加強型疫苗。

技術領域

本發明屬于基因工程疫苗，具體涉及一種展示副溶血弧菌VP1667及VP2369蛋白的副溶血弧菌菌影的制備。

背景技術

細菌菌影（BG）是源自革蘭氏陰性細菌，通常利用噬菌體裂解E蛋白使細菌裂解，在裂解的過程中丟失其內容物而保留的一個完整空殼。它們含有許多先天免疫刺激激動劑，并且是涉及先天和適應性免疫的廣泛細胞類型的有效激活劑。很多研究已經證明BG作為佐劑的有效性以及它們通過一系列免疫和非免疫細胞類型誘導促炎細胞因子產生的能力。這些促炎細胞因子引發T和B淋巴細胞向淋巴結的廣泛募集，最大化提高其與同源抗原相遇的機會，并隨后引發有效的免疫應答。不僅如此，菌影生產工藝簡單，成本低，還可凍干保存，在儲存及運輸方面十分便利。如此多的優點讓菌影疫苗受到了越來越多研究者的認可。

副溶血性弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽，嗜溫，非孢子形成，彎曲的桿狀細菌，廣泛存在于世界各地的海洋和河口環境中。在水體中，易污染海產品，引起水生動物如對蝦、九孔鮑等的死亡。對于人類而言，副溶血性弧菌被認為是最重要的食源性病原體之一，并且是人類急性腸胃炎的主要致病因子。在防治副溶血弧菌感染的研究中，大量文獻報道了副溶血弧菌的一些外膜蛋白可刺激機體產生針對副溶血弧菌的抗體，從而預防副溶血弧菌的感染。其中有研究中指出副溶血弧菌外膜蛋白VP1667及VP2369在乳化后注射斑馬魚，可有效使斑馬魚抵抗副溶血弧菌的感染。

發明內容

本發明針對現有技術中存在的不足，提供了一種展示副溶血弧菌VP1667及VP2369蛋白的副溶血弧菌菌影疫苗的制備，以解決現有技術中存在的問題。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一種展示副溶血弧菌VP1667及VP2369蛋白的副溶血弧菌菌影疫苗的制備，具體包括以下步驟：

（1）構建裂解質粒pJSL20

根據裂解E基因序列設計上下游引物，模板為實驗室已保存溫控裂解質粒pBV220-E。上游引物引入KpnI酶切位點，下游引物引入PstI酶切位點。PCR擴增裂解E基因片段，并將片段純化回收。將裂解E基因片段與載體pBAD24用KpnI，PstI內切酶進行37℃酶切過夜。酶切產物回收后，將基因片段與載體片段進行16℃酶連6 h，酶連產物純化后熱轉化至大腸桿菌DH5α中。篩選陽性細菌送金維智公司測序，將序列正確的重組載體命名為pJSL20。

所述基因克隆使用引物均為金維智公司合成的DNA引物，下劃線標注酶切位點。

引物序列如SEQ ID NO:1~2所示：

裂解E基因片段上游引物lysis-E-F-KpnI：

5'-CGGGGTACCGGTACGCTGGACTTTGTGG-3'

裂解E基因片段下游引物lysis-E-R-PstI：