[發明專利]展示副溶血弧菌VP1667及VP2369蛋白的副溶血弧菌菌影疫苗制備

有效

• 申請號: 201910697119.1
• 申請日: 2019-07-30
• 公開（公告）號: CN110283770B
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 楊夢華;姬生樂;許光治
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/31;C12N15/74;C12N15/66;A61K39/106;A61P31/04;C12R1/63
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 朱欣欣

1.一種展示副溶血弧菌VP1667及VP2369蛋白的副溶血弧菌菌影，其特征在于，制備方法包括如下步驟：

（1）構建裂解質粒pJSL20：

PCR擴增裂解E基因片段，并將片段純化回收，將裂解E基因片段與載體pBAD24用KpnI，PstI內切酶進行37℃酶切過夜，酶切產物回收后，將基因片段與載體片段進行16℃酶連6h，酶連產物純化后熱轉化至大腸桿菌DH5α中，得到pJSL20；

（2）構建Ara和IPTG雙控誘導外膜蛋白及裂解E蛋白表達質粒pJSL24：

①擴增轉錄終止序列rrnbt1t2基因，并在片段上游引物引入SphI酶切位點，下游引物依此引入NotI，HindIII酶切位點；將rrnbt1t2基因片段與載體pJSL20用SphI，HindIII內切酶進行37℃酶切過夜；酶切產物回收后，將基因片段與載體片段進行16℃酶連6 h，酶連產物純化后熱轉化至大腸桿菌DH5α中以構建雙終止子裂解質粒，得到pJSL23；

②以副溶血弧菌菌株基因組為模板，擴增VP1667基因片段，并在片段上游引物引入NdeI酶切位點，下游引物依此引入Flag標簽蛋白序列及EcoRI酶切位點；將此片段與pMal-c2x質粒用NdeI，EcoRI內切酶進行37℃酶切過夜；酶切產物回收后，將基因片段與載體片段進行16℃酶連6 h，酶連產物純化后熱轉化至大腸桿菌DH5α中以構建IPTG誘導VP1667蛋白表達質粒；得到pJSL21；

③以pMal-c2x為模板，以5'-GATGATGATAAGTGAGAGCTGTTGACAATTAATCATC-3'為上游引物，以5'-TTTTTAACACCTATGGTCCTTGTTG-3'為下游引物，擴增獲得基因片段Ptac-L，以副溶血弧菌菌株基因組為模板，擴增VP2369基因片段，并在下游引物依此引入His標簽蛋白序列及NotI酶切位點；將兩個片段通過Overlapping PCR的方式連接成一個片段Ptac-VP2369；

④以pJSL21為模板，擴增從LacI基因序列起始至包含Flag標簽蛋白序列的VP1667基因片段，LacI-Ptac-VP1667；將LacI-Ptac-VP1667與Ptac-VP2369片段通過Overlapping PCR的方式連接成一個長片段LacI-Ptac-VP1667-Ptac-VP2369；長片段上下游引物均引入NotI酶切位點；將此片段與①載體pJSL23用NotI內切酶進行37℃酶切過夜；酶切產物回收后，將基因片段與載體片段進行16℃酶連6 h，酶連產物純化后熱轉化至大腸桿菌DH5α中以構建Ara和IPTG雙控誘導外膜蛋白及裂解E蛋白表達質粒；得到pJSL24；

（3）將pJSL24轉入副溶血弧菌菌株中，得到rVP；

（4）rVP表達外膜蛋白后進行裂解以制備rVPG。

2.根據權利要求1所述的一種展示副溶血弧菌VP1667及VP2369蛋白的副溶血弧菌菌影，其特征在于：所述步驟（2）中同一質粒上轉錄調控的方式為：IPTG控制副溶血弧菌外膜蛋白基因轉錄以及Ara控制裂解E基因的轉錄。

3.根據權利要求1所述的一種展示副溶血弧菌VP1667及VP2369蛋白的副溶血弧菌菌影，其特征在于：所述步驟（3）中轉入方式為三親結合轉移。

4.根據權利要求1所述的一種展示副溶血弧菌VP1667及VP2369蛋白的副溶血弧菌菌影，其特征在于：所述步驟（4）中反應條件為OD₆₀₀=0.3時，同時加入終濃度分別為0.5 mMIPTG及0.1%Ara分別誘導外膜蛋白及裂解E蛋白的表達，裂解時間為9 h。

5.一種利用權利要求1-4中任一項所述的展示副溶血弧菌VP1667及VP2369蛋白的副溶血弧菌菌影在制備預防副溶血弧菌感染疫苗中的應用。