[發明專利]一種抗A型口蹄疫病毒牛源單鏈基因工程抗體的制備方法

在審

• 申請號: 201910694887.1
• 申請日: 2019-07-30
• 公開（公告）號: CN110483638A
• 公開（公告）日: 2019-11-22
• 發明（設計）人: 李坤;曹軼梅;盧曾軍;劉在新;包慧芳;王省;周莎莎;白興文;李平花;付元芳
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N15/13;C12N15/85
• 代理公司: 11569 北京高沃律師事務所
• 代理人: 瞿曉晶<國際申請>=<國際公布>=<進入

本發明涉及一種抗A型口蹄疫病毒牛源單鏈基因工程抗體的制備方法，屬于抗體制備技術領域。本發明所述制備方法通過從免疫A型FMDV滅活疫苗牛體內分離PBMCs，使用染料標A型FMDV 146S抗原，然后對PBMCs進行染色，借助多色流式細胞儀分選能同時分離到結合A型FMDV的單個B細胞，進而獲得VH和VL基因，結合EXPI293表達工程抗體技術，表達獲得A型FMDV特異性牛源單鏈基因工程抗體。本發明所述制備方法避免了傳統鼠雜交瘤技術復雜的細胞融合篩選流程，對研究A型FMDV宿主特異性抗原位點的鑒定具有重要指導意義，可為口蹄疫分子疫苗的研制奠定基礎。

技術領域

本發明涉及抗體制備技術領域，具體涉及一種抗A型口蹄疫病毒牛源單 鏈基因工程抗體的制備方法。

背景技術

口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是嚴重危害豬、牛與羊的重大動 物疫病。口蹄疫病毒(FMDV)有七個血清型，分別為A型、O型、Asia 1 型、C型、SAT1～3型，其中每個血清型又根據流行的區域劃分為多個拓撲 型(VP1，85％氨基酸同源性)。我國主要流行A型和O型FMDV，其中A 型FMDV在我國主要存在亞洲拓撲型中的G1和G2分支。A型和O型FMDV 血清型之間不能提供交叉免疫保護，甚至同一血清型內不同拓撲型病毒之間 也存在抗原結構的差異，不能對異源毒株提供很好的交叉免疫保護。因此， 研究A型FMDV抗原結構對疫苗毒株設計具有重要意義。單克隆抗體無疑 是解析抗原結構的重要工具。

單克隆抗體來源于B細胞，抗體胚系基因VDJ片段通過基因重排和體 細胞突變，產生特異性單個B細胞克隆，B細胞進一步分化成漿細胞，最終 分泌產生特異性單克隆抗體。可以看出抗體胚系基因VDJ重排決定了抗體 的多樣性，然而不同物種在VDJ基因片段數量上存在很大差異。據報道， 小鼠重鏈IGH基因含有101個V基因片段，9個D基因片段，4個J基因片 段。豬重鏈IGH基因約有20個功能性V基因片段,2個D基因片段和1個 J基因片段。目前，牛重鏈IGH基因數據庫中存在12個V基因片段,23個 D基因片段和4J基因片段(http://www.imgt.org/IMGTveterinary/)。抗體分子 中互補決定區(CDRs)是識別抗原表位的重要部位，尤其是重鏈互補決定 區(HCDR3)，影響抗體親和力。牛抗體分子中約10％重鏈序列含有超長 的HCDR3，最長可達約60個氨基酸，這一特性是其他物種，如小鼠和豬等 所不具備的。據報道，牛超長HCDR3結構域可以單獨識別抗原表位。綜上 可以看出，不同物種間VDJ基因組成差異以及CDR3長度差異，以及K/L 輕鏈組成比例差異，所引起的抗體多樣性，勢必可能導致宿主特異性抗原位 點的產生。因此，利用自然宿主來源單抗鑒定其識別抗原位點對解析A型 FMDV抗原結構和疫苗設計具有重要指導意義。目前，用于研究A型FMDV 抗原結構的單克隆抗體主要是鼠源性單克隆抗體。然而由于牛是FMDV的 自然感染宿主，且鼠與牛的B細胞多樣性存在較大差異，因此產生A型 FMDV特異性牛源單克隆抗體對解析A型FMDV抗原結構，尤其是發現 FMDV宿主特異性抗原位點具有重要意義。目前，尚未有A型FMDV特異 性牛源單克隆抗體的報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種抗A型口蹄疫病毒牛源單鏈基因工程抗體 的制備方法。本發明所述制備方法操作簡單、方便，避免了傳統鼠雜交瘤技 術復雜的細胞融合篩選流程，可以通過流式細胞儀直接分選抗原特異性單個 B細胞，體外表達獲得單鏈基因工程抗體，對研究A型FMDV宿主特異性 抗原位點的鑒定具有重要指導意義，可為口蹄疫分子疫苗的研制奠定基礎。

本發明提供了一種抗A型口蹄疫病毒牛源單鏈基因工程抗體的制備方 法，包括以下步驟：

1)從免疫A型FMDV滅活疫苗的牛血液樣本中分離外周血單個核細胞；