[發(fā)明專(zhuān)利]一種抗A型口蹄疫病毒牛源單鏈基因工程抗體的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910694887.1
• 申請(qǐng)日: 2019-07-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110483638A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-11-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李坤;曹軼梅;盧曾軍;劉在新;包慧芳;王省;周莎莎;白興文;李平花;付元芳
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C07K16/10
• 分類(lèi)號(hào): C07K16/10;C12N15/13;C12N15/85
• 代理公司: 11569 北京高沃律師事務(wù)所
• 代理人: 瞿曉晶<國(guó)際申請(qǐng)>=<國(guó)際公布>=<進(jìn)入

1.一種抗A型口蹄疫病毒牛源單鏈基因工程抗體的制備方法，包括以下步驟：

1)從免疫A型FMDV滅活疫苗的牛血液樣本中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞；

2)對(duì)A型FMDV 146S抗原進(jìn)行超濾離心，得到濃縮后的A型FMDV 146S抗原，使用染料對(duì)濃縮后的A型FMDV 146S抗原進(jìn)行染色，將染色后的抗原進(jìn)行超濾離心，得到標(biāo)記后的A型FMDV 146S抗原；

所述染料包括FluoProbes 647H、Allophycocyanin、DyLight 633、DyLight 650、Atto633或Cynaine Dye 5；

3)將步驟1)得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞與步驟2)得到的標(biāo)記后的A型FMDV 146S抗原、鼠抗牛CD21-RPE和鼠抗牛IgM-FITC熒光抗體混合，得到染色后的細(xì)胞；

4)使用多色流式細(xì)胞儀分選A型FMDV特異性單個(gè)B細(xì)胞；

5)對(duì)步驟4)得到的A型FMDV特異性單個(gè)B細(xì)胞進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增，得到A型FMDV特異性單個(gè)B細(xì)胞IgG抗體的重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因；

6)將步驟5)得到的重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因通過(guò)如SEQ ID NO.1的柔性Linker連接，在連接后的基因的N端引入如SEQ ID NO.2所述的信號(hào)肽序列，在C端引入Flag標(biāo)簽和His標(biāo)簽，參考Homo sapiens(Human)密碼子進(jìn)行基因序列優(yōu)化，在優(yōu)化后的基因起始密碼子前引入KOZAK序列，插入到pcDNA3.4表達(dá)載體，得到牛源單鏈抗體表達(dá)載體；

7)將步驟6)得到牛源單鏈抗體表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行抗體的表達(dá)；

所述步驟1)和2)沒(méi)有時(shí)間先后順序的限定。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟1)所述牛血液樣本為免疫A型FMDV滅活疫苗14～30d的牛血液樣本。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟2)所述超濾離心為：使用截留量100kDa的超濾管4000rpm離心10min，將抗原或染色后的抗原置換至PBS緩沖液中。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟4)所述分選為：把每孔含有10μL裂解液的96-PCR孔板放入分選艙，設(shè)置每孔分選1個(gè)細(xì)胞模式，上樣；劃門(mén)圈出淋巴及單核細(xì)胞，根據(jù)FSC-A與FSA-H設(shè)置排除粘連細(xì)胞，圈出對(duì)角線(xiàn)單一細(xì)胞；對(duì)CD21⁺IgM^-A-FMDV⁺細(xì)胞進(jìn)行分選。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟5)所述擴(kuò)增包括巢式PCR擴(kuò)增方法。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟6)使用Not1和Nhel酶切位點(diǎn)插入到pcDNA3.4表達(dá)載體。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟7)所述細(xì)胞包括Expi293懸浮細(xì)胞。