[發明專利]一種基于信號級聯雙重放大系統以高靈敏且快速檢測食源性致病菌的方法

在審

• 申請號: 201910693011.5
• 申請日: 2019-07-30
• 公開（公告）號: CN110514829A
• 公開（公告）日: 2019-11-29
• 發明（設計）人: 葉邦策;左鵬;李傲
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N21/65
• 代理公司: 31203 上海順華專利代理有限責任公司
• 代理人: 顧蘭芳<國際申請>=<國際公布>=<進入

本發明公開了一種基于信號級聯雙重放大系統以高靈敏且快速檢測食源性致病菌的方法，該檢測方法主要分為以下步驟：(1)將致病菌的多/單克隆抗體偶聯至磁珠表面，獲得免疫磁珠；(2)將該免疫磁珠與含有食源性致病菌的樣品混合，通過抗原抗體反應特異性捕獲致病菌；(3)利用引發序列修飾的致病菌適配體及DNA發卡結構探針以引發雜交鏈式反應，獲得HCR產物(帶有切口的雙鏈DNA)；(4)向HCR產物中加入拉曼信號分子和拉曼基底，進行相應的SERS測定，實現信號的級聯放大及輸出。本發明對保障食品安全并預防食源性疾病的發生具有重大意義，同時對于其他生物分析也展現出了巨大的應用潛力。

技術領域

本發明涉及一種基于免疫HCR聯合SERS以高靈敏且快速檢測食源性致病菌的方法，屬于食源性致病菌高靈敏且快速檢測技術領域。

背景技術

近年來，沙門氏菌引發的食品安全問題依舊嚴峻。由于被沙門氏菌污染的食品并不會表現出明顯的感官性狀，因此很容易被人畜誤食，造成食源性疾病的發生。通常，攝入量超過10⁵CFU的沙門氏菌即可使普通人感染，而對于免疫力低下或敏感人群而言，15～20CFU即可致病，因此開發出新型的檢測方法以實現高靈敏地檢測沙門氏菌顯得至關重要。

傳統的檢測方法雖然被視為金標準，但卻費時耗力，整個檢測過程需要4～7天左右，不能滿足即時且靈敏的檢測目的；基于免疫學或分子生物學的檢測方法如ELISA、PCR、LAMP等方法雖然在靈敏度上得到了極大改善，但卻容易出現假陽性問題，因此特異性有待提高。核酸適配體是一段經體外篩選獲得的寡核苷酸序列，可與靶標高親和力強特異性結合，因而可被用于設計成適配體傳感器。HCR作為一種恒溫無酶的核酸擴增技術，由于具有低成本、易合成和穩定性高的優勢，有望結合適配體傳感器替代PCR作為信號放大的手段；另一方面，SERS具有顯著的指紋識別能力和強大的信號放大能力，且無需對樣品進行復雜的前處理，目前已被應用于多種分析方法中，若作為其他放大技術如HCR的信號輸出方式，則有望進一步提高檢測的靈敏度，同時縮短檢測時長。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于免疫HCR聯合SERS進行信號級聯放大以高靈敏檢且快速檢測食源性致病菌的方法，具體技術方案如下：

一種基于信號級聯雙重放大系統以高靈敏且快速檢測食源性致病菌的方法，是基于免疫雜交鏈式反應聯合表面增強拉曼散射的信號級聯雙重放大系統以高靈敏快速檢測食源性致病菌的方法，其特征在于，所述免疫雜交鏈式反應是免疫磁珠通過抗原抗體的特異性反應以捕獲靶標菌，靶標菌再與對應的核酸適配體傳感器反應延伸出HCR產物，最終體系形成了一個“免疫磁珠-靶標菌-DNA雙鏈”的三明治夾心結構復合物。

所述表面增強拉曼散射是，所用的拉曼信號分子嵌入DNA雙鏈中而淬滅拉曼特征譜峰信號；相反，處于游離狀態的拉曼信號分子則通過靜電作用與納米銀顆粒結合形成熱點而生成拉曼特征譜峰，且信號強度與靶標菌的數量在一定范圍內存在相關關系。

所述磁珠為表面修飾了活性基團的磁珠，所述抗體為抗靶標菌多克隆抗體或單克隆抗體。

所述抗靶標菌免疫磁珠的制備方法如下：

取適量修飾了活性基團的磁珠，加入適量緩沖液清洗幾次以除去原保存液，然后加入新鮮配制的活化溶液室溫振蕩半小時以活化磁珠表面的活性基團；加入抗靶標菌多/單克隆抗體，室溫振蕩孵育一段時間，除去剩余的抗體溶液，再用PBST清洗兩次，最后將獲得的免疫磁珠存儲于BSA封閉液中并保存備用。

所述免疫磁珠捕獲靶標菌的方法如下：

取適量免疫磁珠存儲液，于磁力架上除去多余的溶液，再用PBST清洗2～3次，除去多余的BSA，然后加入含有靶標菌的樣品，室溫孵育一定時間，最后用PBST清洗1～2次，獲得免疫磁珠-靶標菌復合物。

所用DNA序列如下：