[發明專利]一種基于信號級聯雙重放大系統以高靈敏且快速檢測食源性致病菌的方法

在審

• 申請號: 201910693011.5
• 申請日: 2019-07-30
• 公開（公告）號: CN110514829A
• 公開（公告）日: 2019-11-29
• 發明（設計）人: 葉邦策;左鵬;李傲
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N21/65
• 代理公司: 31203 上海順華專利代理有限責任公司
• 代理人: 顧蘭芳<國際申請>=<國際公布>=<進入

1.一種基于信號級聯雙重放大系統以高靈敏且快速檢測食源性致病菌的方法，是基于免疫雜交鏈式反應聯合表面增強拉曼散射的信號級聯雙重放大系統以高靈敏快速檢測食源性致病菌的方法，其特征在于，(1)將致病菌的多/單克隆抗體偶聯至磁珠表面，獲得免疫磁珠；(2)將該免疫磁珠與含有食源性致病菌的樣品混合，通過抗原抗體反應特異性捕獲致病菌；(3)利用引發序列修飾的致病菌適配體及DNA發卡結構探針以引發雜交鏈式反應，獲得HCR產物，即帶有切口的雙鏈DNA；(4)向HCR產物中加入拉曼信號分子和拉曼基底，進行相應的SERS測定，實現信號的級聯放大及輸出。

2.根據權利要求書1所述的檢測方法，其特征在于，所述免疫雜交鏈式反應是免疫磁珠通過抗原抗體的特異性反應以捕獲靶標菌，靶標菌再與對應的核酸適配體傳感器反應延伸出HCR產物，體系形成了一個免疫磁珠-靶標菌-DNA雙鏈的結構復合物。

3.根據權利要求書1所述的檢測方法，其特征在于，所述表面增強拉曼散射是，所用的拉曼信號分子嵌入DNA雙鏈中而淬滅拉曼特征譜峰信號；相反，處于游離狀態的拉曼信號分子則通過靜電作用與納米銀顆粒結合形成熱點而生成拉曼特征譜峰，且信號強度與靶標菌的數量在一定范圍內存在相關關系。

4.根據權利要求書1所述的檢測方法，其特征在于，所述磁珠為表面修飾了活性基團的磁珠，所述抗體為抗靶標菌多克隆抗體或單克隆抗體。

5.根據權利要求書1所述的檢測方法，其特征在于，抗靶標菌免疫磁珠的制備方法如下：

取適量修飾了活性基團的磁珠，加入適量緩沖液清洗幾次以除去原保存液，然后加入新鮮配制的活化溶液室溫振蕩半小時以活化磁珠表面的活性基團；加入抗靶標菌多/單克隆抗體，室溫振蕩孵育一段時間，除去剩余的抗體溶液，再用PBST清洗兩次，最后將獲得的免疫磁珠存儲于BSA封閉液中并保存備用。

6.根據權利要求書1所述的檢測方法，其特征在于，免疫磁珠捕獲靶標菌的方法如下：

取適量免疫磁珠存儲液，于磁力架上除去多余的溶液，再用PBST清洗2～3次，除去多余的BSA，然后加入含有靶標菌的樣品，室溫孵育一定時間，最后用PBST清洗1～2次，獲得免疫磁珠-靶標菌復合物。

7.根據權利要求書1所述的檢測方法，其特征在于，所述制備HCR方法如下：

向上述免疫磁珠-靶標菌復合物中加入引發序列修飾的適配體，孵育一段時間，除去未結合的適配體后再加入發卡結構的探針H1和H2，孵育一段時間以引發雜交鏈式反應，除去未反應的探針后，最終獲得免疫磁珠-靶標菌-適配體HCR延伸產物的復合物。

8.根據權利要求書1所述的檢測方法，其特征在于，表面增強拉曼散射檢測方法如下：

設置好拉曼儀的測定條件；向上述免疫磁珠-靶標菌-適配體HCR延伸產物的復合物中加入過量拉曼信號分子，混勻，避光孵育一段時間；再加入適量納米銀膠體，混勻，避光孵育一段時間；取適量體系于玻璃板上，避光條件下扣除背景后測定。