[發(fā)明專利]一種應用槍頭式分散固相微萃取柱純化His標簽融合蛋白的方法

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• 申請日: 2019-07-30
• 公開（公告）號: CN110372772A
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發(fā)明（設計）人: 王倩;安德魯.李;馮玥;楊佳
• 申請（專利權）人: 無錫微色譜生物科技有限公司
• 主分類號: C07K1/36
• 分類號: C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;G01N1/34;G01N1/40
• 代理公司: 江陰市輕舟專利代理事務所(普通合伙) 32380
• 代理人: 孫燕波

本發(fā)明涉及一種應用槍頭式分散固相微萃取柱純化His標簽融合蛋白的方法，采用槍頭式分散固相微萃取柱，內(nèi)含IMtips^TM金屬離子樹脂作為濕性填料，通過從槍頭式分散固相微萃取柱底端吸入的方式，通過簡單的吸打過程，完成His標簽融合蛋白的結合、洗滌、洗脫。在吸液過程中，松散的濕性填料隨溶液向上翻涌至湍流區(qū)，與樣品快速混合，利用渦旋混合保證填料與樣品具有更大的接觸表面積，使得相對于其他親和純化柱具有更快的結合或洗脫速度，可高效的完成洗滌、洗脫過程，不僅節(jié)省純化時間還能顯著減少溶劑的用量。在與自動移液系統(tǒng)配套使用時，可同時進行數(shù)十甚至數(shù)百個樣品的批量處理，實現(xiàn)在短時間內(nèi)同時純化多個樣品，屬于一種快速、高通量的蛋白純化過程。

技術領域

本發(fā)明涉及固相萃取分離裝置，以及利用該固相萃取分離裝置對His標簽融合蛋白的純化方法。

背景技術

近年來，重組蛋白的應用有了顯著增長，與此同時，用于重組蛋白表達和純化的技術和產(chǎn)品也得以增長。自從親和標簽融合技術出現(xiàn)以來，多種多樣的短肽或蛋白親和標簽極大地方便了外源表達重組蛋白的分離與蛋白質復合體的純化，已成為蛋白質研究領域不可或缺的工具。它們不僅便于對融合蛋白的檢測與純化，而且可能對目標蛋白的理化性質產(chǎn)生有利的影響，可以提高重組蛋白的產(chǎn)量，增強重組蛋白的可溶性，促進重組蛋白的正確折疊。并且具有結合特異性高、純化步驟簡便、純化條件溫和、適用性廣泛等優(yōu)點，為蛋白質的有效純化提供了一條解決的途徑，廣泛應用于蛋白質結構與功能的研究及重組蛋白純化工藝的開發(fā)中。

多聚組氨酸標簽(His-tag)是目前高通量蛋白純化最普遍使用的親和標簽，廣泛用于多種重組蛋白在各種表達系統(tǒng)的表達與純化中。His標簽一般為5～15個組氨酸，被認為是重組蛋白純化的首選標簽，具有以下優(yōu)點：(1)位于目標蛋白N端的His標簽與細菌的轉錄翻譯機制相互兼容，利于蛋白的表達；(2)His標簽幾乎不影響目標蛋白的理化性質；(3)His標簽很小，不會改變目標蛋白的可溶性；(4)His標簽在目標蛋白結晶后對蛋白結構幾乎沒有影響；(5)采用固定化金屬離子親和層析純化His標簽融合蛋白時，其操作非常簡便。基于上述優(yōu)點，His標簽融合蛋白的固定化金屬離子親和層析(immobilized metal-ionaffinity chromatography,IMAC)被作為主要的蛋白純化方法。

His標簽融合蛋白一般采用固定化金屬離子親和層析進行分離純化。固定化金屬離子親和層析，又稱金屬螯合層析，是上世紀70年代中期發(fā)展起來的一種新型分離技術。這一純化技術是基于His標簽序列中連續(xù)的組氨酸與固定化金屬離子，如Ni²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺等之間的親和力。金屬離子通過螯合作用經(jīng)一個與固相支持物共價結合的反應基團被固定在樹脂上。自從His標簽出現(xiàn)以來，已利用固定化金屬離子親和層析分離純化了眾多的His標簽融合蛋白與多肽。更重要的是，由于His標簽具有高度的結合特異性，因而在變性與非變性條件下均可以進行融合蛋白的親和純化，使得該標簽的應用范圍更廣。

從重組蛋白的表達優(yōu)化，到小量誘導純化，再到中試、大規(guī)模生產(chǎn)需要眾多繁瑣、大量的工作，包括上游蛋白突變體的篩選、功能鑒定，各階段誘導表達及純化條件的優(yōu)化及QA、QC等多個環(huán)節(jié)?？焖佟⒖煽?、高效的自動化分離分析技術可將極大地提到效率，降低時間、人員成本。如何在高重現(xiàn)性的條件下，最小的人為干預的情況下，高通量、小規(guī)模的蛋白的生產(chǎn)和純化成為關鍵，從而避免把時間浪費在反復摸索蛋白樣品制備方案上。磁珠法(Magnetic Beads)、離心萃取法(Spin Column)以及重力柱法是常見的實驗室蛋白純化的方法，但這些方法有的通量較低，價格昂貴、不能反復清洗使用等缺點。

發(fā)明內(nèi)容