[發明專利]一種應用槍頭式分散固相微萃取柱純化His標簽融合蛋白的方法

在審

• 申請號: 201910691782.0
• 申請日: 2019-07-30
• 公開（公告）號: CN110372772A
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發明（設計）人: 王倩;安德魯.李;馮玥;楊佳
• 申請（專利權）人: 無錫微色譜生物科技有限公司
• 主分類號: C07K1/36
• 分類號: C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;G01N1/34;G01N1/40
• 代理公司: 江陰市輕舟專利代理事務所(普通合伙) 32380
• 代理人: 孫燕波

1.一種應用槍頭式分散固相微萃取柱純化His標簽融合蛋白的方法，其特征在于：包括如下步驟，

（1）槍頭式分散固相微萃取柱規格選擇：采用槍頭式分散固相微萃取柱，內含 IMtips^TM金屬離子樹脂作為濕性填料；結合緩沖液組成：磷酸鈉，氯化鈉，咪唑，pH 7±0.5；

（2）樣品處理：將原液離心，棄去上清液，用結合緩沖液重懸菌體沉淀，超聲破碎菌體，離心后取上清液作為樣品溶液；

（3）預處理：取出槍頭式分散固相微萃取柱，與移液器緊密結合后，吸入結合緩沖液緩沖液，吸液過程中使微萃取柱中金屬離子樹脂充分重懸，打出液體，如此反復吸打數次，最后排空棄掉全部的結合緩沖液；

（4）樣品吸附：用步驟（3）中預處理后的萃取柱吸入步驟（2）中準備的樣品溶液，吸液過程中使微萃取柱中金屬離子樹脂充分重懸，打出液體，如此反復吸打數次，最后排空；

（5）洗滌：繼續吸入結合緩沖液，吸液過程中使微萃取柱中金屬離子樹脂充分重懸，打出液體，如此反復吸打數次，最后排空棄掉結合緩沖液；

（6）目的蛋白洗脫：一次或分多次吸入洗脫緩沖液，含磷酸鈉、NaCl、咪唑，吸液過程中使微萃取柱中金屬離子樹脂充分重懸，打出液體，如此反復吸打數次，最后將液體排出到干凈的樣品管中，即為純化得到的蛋白溶液；

中和、透析：向步驟（6）純化過的蛋白溶液中加入Tris buffer或選擇中性溶液進行透析。

2.根據權利要求1所述的應用槍頭式分散固相微萃取柱純化His標簽融合蛋白的方法，其特征在于：所述槍頭式分散固相微萃取柱包括錐形移液管和連接管，所述錐形移液管和連接管為一整體成型件，在錐形移液管的尖頭端和連接管的上端分別設置有可脫卸的保護帽體，所述錐形移液管的尖頭管口處設置有過濾層，所述過濾層具有能夠使液體試樣通過的孔或孔隙結構；所述過濾層的上方為填料層，所述填料層為堆積在所述過濾層上方的松散的濕性填料；所述濕性填料上方為湍流室，所述湍流室上部設置有透氣擋板；所述液體試樣由下而上經所述過濾層過濾將濕性填料沖散，裹挾著濕性填料的液體試樣沖入倒錐形的湍流室完成親和吸附；所述連接管位于移液管的上端，所述連接管作為密封接頭，所述連接管具有光滑的內壁。

3.根據權利要求2所述的應用槍頭式分散固相微萃取柱純化His標簽融合蛋白的方法，其特征在于：所述填料層上方設置有分散環，所述分散環為能夠在湍流室內上下自由浮動，當液體試樣或氣體從下端吸入時，分散環會隨之上下浮動，和填料反復接觸，促進填料在湍流室內湍流混合；或所述分散環為設置在錐形移液管內壁的突出環，或所述分散環為帶有分配孔的網孔結構。

4.根據權利要求2所述的應用槍頭式分散固相微萃取柱純化His標簽融合蛋白的方法，其特征在于：所述過濾層選自多孔玻璃、多孔氧化物、玻璃纖維、多孔高分子或金屬網中的一種或幾種的混合。

5.根據權利要求2所述的應用槍頭式分散固相微萃取柱純化His標簽融合蛋白的方法，其特征在于：所述濕性填料的體積占移液管體積的0.3%～15%。

6.根據權利要求1所述的應用槍頭式分散固相微萃取柱純化His標簽融合蛋白的方法，其特征在于：所述結合緩沖液組成：20 mM 磷酸鈉，0.5 M 氯化鈉，20～40 mM 咪唑，pH7.4；所述洗脫緩沖液的組成：20 mM 磷酸鈉，0.5 M NaCl, 500 mM 咪唑，pH 7.4。

7.根據權利要求1所述的應用槍頭式分散固相微萃取柱純化His標簽融合蛋白的方法，其特征在于：所述槍頭式分散固相微萃取柱與手動移液管搭配進行小批量純化操作，或與自動移液工作站搭配同步操作多個槍頭式分散固相微萃取柱進行高通量純化操作。

8.根據權利要求7所述的應用槍頭式分散固相微萃取柱純化His標簽融合蛋白的方法，其特征在于：所述自動移液工作站包括Hamilton Microlab Nimbus 液體處理自動工作站、Integra 液體處理自動工作站。