[發明專利]用于檢測CYP2C9基因和VKORC1基因多態性的探針、引物、試劑盒

在審

• 申請號: 201910691202.8
• 申請日: 2019-07-29
• 公開（公告）號: CN112301121A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 毛丹丹;張小燕;張奕;傅詠南
• 申請（專利權）人: 上海利康精準醫療技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12N15/11
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本發明公開了一種用于檢測CYP2C9基因和VKORC1基因多態性的探針、引物、試劑盒，其中探針的序列如SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:4、或SEQ ID NO.:7所示，或者在SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:7的序列兩端加以基團修飾。本發明的用于檢測CYP2C9基因和VKORC1基因多態性的探針、引物、試劑盒，在檢測CYP2C9基因和VKORC1基因多態性時，具有靈敏度高、特異性好、快速、高通量檢測等優點。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體的說涉及用于檢測CYP2C9基因和VKORC1基因多態性的探針、引物、試劑盒。

背景技術

華法林是目前臨床上使用最早、最多、最廣的口服抗凝藥，已被應用于多種疾病的抗凝治療，如靜脈血栓栓塞性疾病(VTE)的一級和二級預防、心房顫動血栓栓塞的預防、瓣膜病、人工瓣膜置換術和心腔內血栓形成等，但其臨床療效和不良反應個體差異很大，劑量很難掌握，尤其在使用華法林抗凝治療初期，極易導致嚴重的出血并發癥。據估計，每年有15.2％的人發生出血副作用，其中致命的大出血占3.5％，不同個體間華法林穩定劑量的差異可達20倍以上。

CYP2C9是細胞色素P450酶(CYP)第二亞家族中的重要成員，占肝微粒體P450蛋白總量的20％。CYP2C9參與抗凝血藥、抗驚厥藥、降糖藥、非甾體類解熱鎮痛抗炎藥、抗高血壓藥以及利尿藥等多種藥物的羥化代謝，其中華法林、甲苯磺丁脲和苯妥因均為治療指數較窄的藥物。CYP2C9活性變化可導致這些藥物體內濃度出現較大變化，甚至導致嚴重藥物不良反應的發生。CYP2C9*2(rs1799853，C430T，Arg144Cys)和CYP2C9*3(rs1057910，A1075C，Ile359Leu)均導致CYP2C9酶活性降低，CYP2C9*3純合子個體酶活性僅為該位點野生型純合子基因型個體(攜帶CYP2C9*1或Arg144/Ile359等位基因)的4～6％。CYP2C9遺傳多態性導致其酶活性變化，從而導致藥物代謝種族和個體差異現象。

維生素k氧化還原酶是抗凝藥物華法林的作用靶點。維生素K環氧化物還原酶復合物1的編碼基因VKORC1的遺傳變異可通過影響VKORC1表達，從而影響華法林的敏感性。位于該基因啟動子區(-1639GA)的單核苷酸突變rs9923231可影響VKORC1的表達，是導致華法林用藥劑量個體差異的主要原因之一。與該位點AA基因型患者相比，-1639GA和GG基因型患者平均華法林劑量分別增加52％(95％CI：41～64％)和102％(95％CI：85～118％)。VKORC1多態性對華法林劑量影響的比重因種族而異，-1639GA和GG基因型對白種人華法林劑量的影響比對亞洲人的影響分別高10％和50％。總體上，VKORC1多態性在不同種族不同人群中可解釋約27％華法林用藥劑量的個體差異。VKORC1-1639A等位基因在亞洲人、白種人和黑種人群中的等位基因頻率分別為91.17％、38.79％和10.81％(根據千人數據庫的結果：在亞洲人、白種人和黑種人群中的等位基因頻率分別為92％、40％和7％)，其頻率分布的種族差異與華法林用藥劑量差異間具有很好的相關性。VKORC1多態性同時也影響華法林用藥的臨床后果。

大量研究表明，在我國華法林代謝酶基因CYP2C9*2和CYP2C9*3位點多態性和華法林靶點基因VKORC1-1639GA位點多態性與其抗凝療效密切相關，不同基因型患者所需華法林劑量差異明顯。美國FDA于2010年對華法林的說明書進行更新，建議結合VKORC1和CYP2C9基因型考慮華法林的初始用藥劑量，從而達到輔助優化華法林的使用目的，并降低出血危險。

目前普遍應用的突變檢測方法為DNA直接測序法，PCR產物直接進行DNA序列分析，可以明確突變位點，但存在費時費力，成本較昂貴，不適用于對大量樣本進行檢測等缺點。因此，需要開發一種適合大批量樣本檢測的方法。

發明內容