[發明專利]一種枸杞葉綠體基因組DNA的提取方法

在審

• 申請號: 201910689363.3
• 申請日: 2019-07-29
• 公開（公告）號: CN110423744A
• 公開（公告）日: 2019-11-08
• 發明（設計）人: 朱珠;陳建;殷慧敏
• 申請（專利權）人: 甘肅農業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京中索知識產權代理有限公司 11640
• 代理人: 周國勇

本發明公開了一種枸杞葉綠體基因組DNA的提取方法，包括以下步驟：選擇枸杞；稱取枸杞葉片，洗凈擦干，去中脈后剪成碎片，放入預冷的研缽中，加入預冷的分離緩沖液充分研磨；過濾并收集濾液，進行第一次離心，棄沉淀，進行第二次離心，對上清液進行第三次離心，棄去上清液，沉淀用預冷的分離緩沖液懸浮，并分成等份；在離心管中，將輕液鋪于重液上層，將懸浮液鋪于輕液上層，進行第四次離心，用移液槍小心收集接口處的條帶，并用等體積不含BSA的分離緩沖液懸浮；從所提取的葉綠體溶液中分離出DNA。該方法能夠獲得純度高、產量大的枸杞cpDNA，為后續枸杞葉綠體基因組測序提供便捷，從而在葉綠體基因工程領域上實現更大的突破。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體地說，涉及一種枸杞葉綠體基因組DNA的提取方法。

背景技術

葉綠體是綠色植物進行光合作用和能量轉化的重要細胞器，也是植物細胞質遺傳的重要單位。葉綠體擁有自身完整的一套基因組，即葉綠體DNA(chloroplast DNA,cpDNA)，在組織結構上具有高度保守性(Jansen R K,Raubeson L A,Boore J L,et al.Methodsfor obtaining and analyzing whole chloroplast genome sequences[J].Methods inenzymology,2005,395:348-384.)。葉綠體基因組所包含的信息雖然遠小于核基因組，但是其基因結構及序列信息在揭示物種進化和不同物種之間的親緣關系等方面都有非常重要價值，因此葉綠體基因組信息被廣泛應用于植物系統發育和比較基因組學研究。

獲得高純度、高產量的cpDNA是進行葉綠體基因組測序分析研究的前提條件及環節之一。然而，由于cpDNA含量太少，只占總DNA的5％，同時在提取過程中有諸多因素干擾，如核DNA、RNA、蛋白質等的污染，導致很難獲得純度高、濃度大的cpDNA。已報道的文獻中有關植物cpDNA的提取主要集中于草本植物，對于多年生木本植物而言，只有枇杷(孫曉榮，易鼎杰，何橋，等.三倍體枇杷葉綠體DNA提取方法的優化[J].西南師范大學學報：自然科學版,2012,37(2):93-96.)、厚樸(李西文，胡志剛，林小涵，等.基于454FLX高通量技術的厚樸葉綠體全基因組測序及應用研究[J].藥學學報,2012,47(1):124-130.)等成功提取了cpDNA。

枸杞(Lycium barbarum L.)隸屬于茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium)，是一種藥用和食用價值極高的物種，具有很高的經濟效益。枸杞屬植物在世界分布較廣，全球約有80種左右，我國枸杞有7種，3變種，此種分類僅限于形態差異及初步核型分析，而利用葉綠體基因組測序研究枸杞屬不同植物在系統進化中的起源、親緣關系及遺傳多樣性相關研究仍未開展。限制此項研究除測序技術外，提取高質量枸杞cpDNA是其中的重要前體及原因。此外，由于枸杞含有大量多糖多酚，加大了其DNA提取的難度。因此目前還沒有一套合適的提取方法能夠提取出高純度、高產量的枸杞cpDNA。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種枸杞葉綠體基因組DNA的提取方法，該方法能夠獲得純度高、產量大的枸杞cpDNA，為后續枸杞葉綠體基因組測序提供便捷，從而在葉綠體基因工程領域上實現更大的突破。

為了解決上述技術問題，本發明公開了一種枸杞葉綠體基因組DNA的提取方法，包括以下步驟：

步驟1、材料及前處理：選擇枸杞，采集枸杞葉片之前，對枸杞枝葉進行暗處理；