[發明專利]一種枸杞葉綠體基因組DNA的提取方法在審
| 申請號： | 201910689363.3 | 申請日： | 2019-07-29 |
| 公開（公告）號： | CN110423744A | 公開（公告）日： | 2019-11-08 |
| 發明（設計）人： | 朱珠;陳建;殷慧敏 | 申請（專利權）人： | 甘肅農業大學 |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10;C12Q1/6806 |
| 代理公司： | 北京中索知識產權代理有限公司 11640 | 代理人： | 周國勇 |
| 地址： | 730070 *** | 國省代碼： | 甘肅;62 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 枸杞 分離緩沖液 預冷 葉綠體基因組DNA 上清液 葉綠體 輕液 沉淀 懸浮 上層 基因工程領域 葉綠體基因組 枸杞葉片 研磨 接口處 離心管 懸浮液 移液槍 擦干 測序 稱取 放入 條帶 洗凈 研缽 重液 過濾 并用 | ||
1.一種枸杞葉綠體基因組DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步驟：
步驟1、材料及前處理：選擇枸杞，采集枸杞葉片之前，對枸杞枝葉進行暗處理；
步驟2、葉綠體的分離：稱取枸杞葉片，洗凈擦干，去中脈后剪成1cm2大小的碎片，放入預冷的研缽中，加入預冷的分離緩沖液充分研磨；用4層紗布過濾并收集濾液，進行第一次離心，棄沉淀，進行第二次離心，對上清液進行第三次離心，棄去上清液，沉淀用1mL預冷的分離緩沖液懸浮，并分成等份；配置0.6mL80％Percoll溶液和1mL40％Percoll溶液，在2mL離心管中，吸取40％Percoll溶液于80％Percoll溶液之上，再小心吸取懸浮液于40％Percoll溶液之上，進行第四次離心，用移液槍小心收集接口處的條帶，并用等體積不含BSA的分離緩沖液懸浮；
步驟3、DNA的提取：使用DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒，按照說明書要求，從所提取的葉綠體溶液中分離出DNA。
2.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟1中的對枸杞枝葉進行暗處理具體為：將生長健康，無病蟲害的枸杞枝條或整個植株在黑暗條件下生長24-36小時。
3.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟2中的分離緩沖液為0.33M山梨醇，5mM MgCl2，1mM DTT，5mM NaH2PO4，5mM Na2HPO4，0.1％BSA，pH＝6.8。
4.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟2中的枸杞葉片與預冷的分離緩沖液的質量體積比(g/mL)為1:5-1:10。
5.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟2中的第一次離心和第二次離心溫度為4℃，離心轉速為200g，離心時間為3分鐘；第三次離心溫度為4℃，離心轉速為1000g，離心時間為7分鐘，第四次離心溫度為4℃，離心轉速為1700g，離心時間為6分鐘。
6.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟3中的DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司新型植物基因組提取試劑盒(DP320)。
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