[發明專利]一種人類EGFR基因突變位點T790M的檢測試劑及檢測方法

在審

• 申請號: 201910687652.X
• 申請日: 2019-07-29
• 公開（公告）號: CN110373467A
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發明（設計）人: 金勝男;丁春明;欒菊
• 申請（專利權）人: 溫州醫科大學
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 溫州金甌專利事務所(普通合伙) 33237
• 代理人: 林益建

1.一種人類EGFR基因突變位點T790M的檢測試劑，其特征在于，該檢測試劑包括：

PCR反應液I；

PCR反應液II；

酶消化反應液；

單堿基延伸液I；

單堿基延伸液II；

磁微粒混懸液；

其中，所述的PCR反應液I包含EGFR基因突變位點T790M的擴增上下游引物及其變體；

其中，所述的PCR反應液II包含PCR反應所需的DNA聚合酶、dNTP、buffer；

其中，所述的酶消化反應液可以消化掉反應體系中的dNTPs；

其中，所述的單堿基延伸液I包含EGFR基因突變位點T790M的延伸引物及其變體；

其中，所述的單堿基延伸液II包含單堿基延伸反應所需的iPLEX酶、生物素標記ddT和buffer；

其中，所述的磁微粒混懸液中的磁微粒標記親和素。

2.根據權利要求1所述的一種人類EGFR基因突變位點T790M的檢測試劑，其特征在于，所述的擴增上下游引物及其變體以EGFR c.2369C>T的上下游75bp為靶序列設計。

3.根據權利要求1所述的一種人類EGFR基因突變位點T790M的檢測試劑，其特征在于，所述的擴增上下游引物及其變體均包含：5’端的附加序列和3’端的互補序列；所述的附加序列與模板序列完全不能匹配互補或能部分匹配互補；所述的附加序列用于提高整個PCR引物的分子量，以區別延伸產物；所述的互補序列與EGFR DNA完全互補。

4.根據權利要求3所述的一種人類EGFR基因突變位點T790M的檢測試劑，其特征在于，

所述的擴增上下游引物的附加序列均為：

附加序列：5’-ACGTTGGATG-3’；

所述的擴增上下游引物的互補序列分別為：

上游引物的互補序列：5’-ATCTGCCTCACCTCCACC-3’；

下游引物的互補序列：5’-TGTTCCCGGACATAGTCC-3’；

所述的擴增上下游引物為：

上游引物:5’-ACGTTGGATGATCTGCCTCACCTCCACC-3’；

下游引物:5’-ACGTTGGATGTGTTCCCGGACATAGTCC-3’。

5.根據權利要求1所述的一種人類EGFR基因突變位點T790M的檢測試劑，其特征在于，所述的延伸引物及其變體與突變位點上游的序列互補，其3’端末位堿基正好與EGFRc.2369C>T上游第一個堿基互補配對，延伸引物：5’-CGTGCAGCTCATCA-3’。

6.一種包含權利要求1-5任一項所述的檢測試劑的人類EGFR基因突變位點T790M的檢測方法，其特征在于，該方法可以對血液或身體組織中EGFR基因突變位點T790M進行檢測，該方法通過PCR擴增目的片段，再利用延伸引物特異性擴增突變基因，進一步磁微粒技術富集提高準確度和靈敏度后檢測。

7.根據權利要求6所述的一種人類EGFR基因突變位點T790M的檢測方法，該方法包括以下步驟：

1)樣本制備：石蠟包埋組織，新鮮組織，冰凍包埋組織，血液，血漿和胸水常規處理提取DNA樣本；

2)目的片段PCR擴增：向反應管中加入PCR反應液I，PCR反應液II，DNA樣本，配制PCR反應體系；PCR儀設置PCR反應條件，進行PCR；

3)酶消化：加入PCR反應產物與酶消化反應液混合，一定條件下反應，反應完成后，進行酶的滅活；

4)單堿基延伸：向反應管中加入單堿基延伸液I，單堿基延伸液II和PCR-SAP產物，進行混合，PCR儀設置PCR反應條件，進行單堿基延伸；

5)磁珠富集反應：按一定比例范圍加入磁微粒混懸液和延伸產物混勻并第一次孵育，產物置于磁力架上待磁珠完全吸附后棄去上清液，并用HPLC-水清洗磁珠，磁珠重懸于生物素包被液中第二次孵育，后短暫離心后進行脫鹽；

6)點樣與數據分析：脫鹽后的樣品點樣至CPM芯片與基質混合后，進行質譜檢測并數據分析。