[發(fā)明專利]一種人類EGFR基因突變位點T790M的檢測試劑及檢測方法

在審

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• 申請日: 2019-07-29
• 公開（公告）號: CN110373467A
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金勝男;丁春明;欒菊
• 申請（專利權(quán)）人: 溫州醫(yī)科大學
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 溫州金甌專利事務(wù)所(普通合伙) 33237
• 代理人: 林益建

一種人類EGFR基因突變位點T790M的檢測試劑及檢測方法,該檢測試劑包括：PCR反應(yīng)液I、PCR反應(yīng)液II、酶消化反應(yīng)液、單堿基延伸液I、單堿基延伸液II和磁微粒混懸液；基于該試劑的檢測方法包括PCR反應(yīng)液I，PCR反應(yīng)液II對血樣中的EGFR基因擴增，并加入酶消化反應(yīng)液消化，消化的產(chǎn)物加入單堿基延伸液I，單堿基延伸液II和PCR?SAP產(chǎn)物進行單堿基延伸，產(chǎn)物磁珠富集后進行芯片分析。本發(fā)明提供的用于檢測人類EGFR基因p.T790M突變的檢測試劑及方法能從10^4個DNA分子中檢測到低至10個突變DNA，其靈敏度達到0.1％，實現(xiàn)T790M的微量檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及人類EGFR基因突變位點p.T790M(c.2369C>T)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及PCR 技術(shù)和單堿基延伸反應(yīng)，結(jié)合磁微粒技術(shù)，實現(xiàn)p.T790M的微量檢測。

背景技術(shù)

EGFR是一種細胞膜表面的糖蛋白受體，具有酪氨酸激酶(Tyrosine Kinase，TK)活性，是 原癌基因c-erbB-1(HER-1)的表達產(chǎn)物。EGFR的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有：PI3K-PDK通路， RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK通路，PLC-γ通路，JAK-STAT通路。通過這些途徑，將胞外信號轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)信號，從而有效應(yīng)對外界的信號刺激，調(diào)節(jié)細胞的生長、增殖、分化，抑制細胞的凋 亡。

美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)于2003年批準了阿斯利康(Astrazeneca)公司的EGFR 小分子靶向藥物吉非替尼(Gefitinib，即：易瑞沙/Iressa)用于治療晚期非小細胞肺癌(NSCLC)， 我國于2005年批準了吉非替尼進入臨床治療。作為EGFR特異的可逆性酪氨酸激酶抑制劑 (EGFR-TKI)，吉非替尼通過與ATP競爭結(jié)合酪氨酸激酶，發(fā)揮其抑制作用。

隨著吉非替尼的廣泛使用，約50-65％的患者在治療1-2年后出現(xiàn)了耐藥，主要的分子機制 是獲得性耐藥突變EGFR p.T790M(c.2369C>T)的出現(xiàn)。該位點位于EGFR酪氨酸激酶的ATP 結(jié)合區(qū)域，氨基酸由T(蘇氨酸)改變?yōu)镸(甲硫氨酸)后，則降低該區(qū)域與ATP的親和性，從 而降低藥物的有效性。因此，在用藥前和藥物使用過程中盡早發(fā)現(xiàn)p.T790M(c.2369C>T)耐藥 突變，具有重要的臨床意義。

目前，針對EGFR p.T790M基因突變的檢測方法較多，靈敏度為29-71％，特異性為67-100％。 針對微量基因突變檢測方法主要有Super ARMS-PCR方法、液滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)、高通量測序(Next-Generation Sequencing，NGS)等方法。Super ARMS PCR靈敏度約 0.2-0.8％，ddPCR和NGS可檢測到低至0.1％的突變，但前者存在假陽性結(jié)果、檢測閾值不易確 定等缺點，后者對儀器設(shè)備、檢驗人員和數(shù)據(jù)分析要求較高，周期較長、費用較高等缺點，都不 易于臨床推廣。

因此，若能在大量正常DNA背景下，快速準確靈敏地檢測出微量的EGFR p.T790M(c.2369C>T)突變，對于臨床EGFR靶向藥物的治療策略，為患者爭取治療時機具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

技術(shù)問題如下：

第一方面，本發(fā)明提供了一種能從大量正常DNA背景下，快速準確靈敏地檢測出微量的人 類EGFR p.T790M(c.2369C>T)突變的方法。

第二方面，本發(fā)明提供了一種人類EGFR基因突變位點T790M的檢測試劑。

技術(shù)方案如下：

一種人類EGFR基因突變位點T790M的檢測試劑，該檢測試劑包括：

PCR反應(yīng)液I；

PCR反應(yīng)液II；

酶消化反應(yīng)液；