[發明專利]基于類彈性蛋白展示N-端腦鈉肽前體雙抗原表位的制備方法

在審

• 申請號: 201910687576.2
• 申請日: 2019-07-29
• 公開（公告）號: CN110358785A
• 公開（公告）日: 2019-10-22
• 發明（設計）人: 胡學軍;楊春光;付鑫
• 申請（專利權）人: 大連大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/62
• 代理公司: 大連八方知識產權代理有限公司 21226
• 代理人: 衛茂才

本發明公開一種利用大腸埃希菌制備類彈性蛋白展示N?端腦鈉肽前體雙抗原表位重組蛋白的方法，其中設計了NT?proBNP第13?20位氨基酸殘基表位和第63?71位氨基酸殘基表位，通過柔鏈將這兩個表位連接并通過柔鏈與類彈性蛋白標簽融合，將編碼后的以上重組蛋白融合基因合成并克隆到原核表達載體上，構建成ELP展示NT?proBNP雙抗原表位基因的融合表達載體，利用大腸埃希菌表達系統表達ELP展示NT?proBNP雙抗原表位重組蛋白。本發明依據ELP多次可逆相變循環(ITC)的突出特性高效、快速、簡便地純化出NT?proBNP雙抗原表位重組蛋白，直接用于夾心ELISA法檢測NT?proBNP校準品。

技術領域

本發明屬于生物標志物制備領域，具體涉及基于類彈性蛋白展示N-腦鈉肽前體雙抗原表位的制備方法。

背景技術

NT-proBNP作為鑒定心衰和檢測心衰嚴重程度的標志物被廣泛用于心血管疾病的診斷治療及預后應用中。NT-proBNP作為檢測抗原校準品的來源包括心衰患者血漿分離、化學合成、大腸埃希菌重組和真核細胞重組表達等。這幾種來源成本較高，純化過程復雜，或者穩定性較差。目前較好的NT-proBNP檢測系統是“夾心免疫檢測系統”。該系統包含捕獲抗體和檢測抗體，捕獲抗體通過結合到NT-proBNP相對穩定的抗原決定簇而捕獲抗原，檢測抗體通過識別另一個抗原決定簇而檢測抗原，這種檢測系統穩定性更高。

所述的“抗原決定簇”（antigenic determinant）也稱為抗原表位（antigenicepitope），是指抗原表面上決定抗原特異性的化學基團。研究顯示，心衰患者血漿中的NT-proBNP是O-糖基化蛋白，其中心區域28-56位氨基酸殘基部位被糖基化，很難被識別這個區域表位的抗體檢測出來，為了確保檢測人血漿中NT-proBNP的準確性，HyTest公司推薦該公司篩選出的15C4_63-71-13G12_13-20抗體組合作為捕獲抗體-檢測抗體，可分別與NT-proBNP分子第63-71位和13-20位氨基酸殘基表位高效親和，不受糖基化影響，適用于NT-proBNP精確檢測系統。

類彈性蛋白(elastin-like polypeptide，ELP) 是一種獨特的重組蛋白，一般作為分離純化標簽使用。ELP[n]的主要結構由五肽重復序列單元(VPGXG)串聯組成，其中客座殘基X可以是除脯氨酸以外的任一氨基酸，n代表ELP鏈中五肽重復次數，ELP具有溫度誘導的可逆相變性質，當ELP與目的蛋白融合后，賦予重組蛋白類似的可逆相變性質。利用多次可逆相變循環(inverse transition cycling，ITC)之后，就可以從蛋白混合液中選擇性地分離出ELP融合蛋白。

公告號CN 106222189 U的專利提供了一種基于類彈性蛋白標簽制備重組N-端腦鈉肽前體的方法，該方法通過基因重組，將N-端腦鈉肽前體基因克隆到pET28a(+)/ELP[I]40 原核表達載體上，將重組表達載體轉入到大腸桿菌BL21(DE3)進行表達，收集菌體后，利用多次可逆相變循環ITC方法純化重組蛋白，該蛋白即為ELP[I] 40 -NT-proBNP重組蛋白。該方法可快速、簡便、高效純化具有與抗NT-proBNP抗體結合活性的融合蛋白，為高效低成本制備具有腦鈉肽前體抗原性的標準品奠定基礎。為實現快速、大規模分離制備具有NT-proBNP抗原特性的重組抗原表位融合蛋白的目標可以看作起到基礎性的一種引導作用。

發明內容

本發明目的是提供一種基于類彈性蛋白展示N-端腦鈉肽前體雙抗原表位的制備方法，實現降低生產成本，實現快速、大規模分離制備具有NT-proBNP抗原特性的重組抗原表位融合蛋白的目標。

為實現上述目的，采用的以下技術方案：