[發明專利]一種基于固態納米孔結腸癌kras基因突變檢測方法

在審

• 申請號: 201910685231.3
• 申請日: 2019-07-27
• 公開（公告）號: CN110408677A
• 公開（公告）日: 2019-11-05
• 發明（設計）人: 譚生偉
• 申請（專利權）人: 蘇州麗納芯生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6809
• 分類號: C12Q1/6809
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明公開了一種基于固態納米孔結腸癌kras基因突變檢測方法,包括以下步驟：A、將流體裝置以及墊片進行清洗，吹干待用；B、將前后的納米孔分別和墊片，流體裝置組裝在一起；C、組裝完之后的納米孔芯片分別組成了小腔室；D、將1M/1M KCl溶液注入到納米孔芯片的小腔室內；E、測量修飾納米孔前后的電流和電壓；F、在cis面的溶液中加入目標堿基的K?ras癌基因片段，突變型基因密碼子發生了點突變，導致酶切位點丟失，所以不會被切斷，本發明突變型基因密碼子發生了點突變，導致酶切位點丟失，所以不會被切斷，經電壓反饋控制將突變的K?ras基因和野生型的K?ras基因測量電輸出信號，通過測量離子電流的變化實現K?ras基因突變的檢測。

技術領域

本發明涉及基于固態納米孔結腸癌kras基因突變檢測技術領域，具體為一種基于固態納米孔結腸癌kras基因突變檢測方法。

背景技術

結腸癌是常見的發生于結腸部位的消化道惡性腫瘤，好發于直腸與乙狀結腸交界處，以40～50歲年齡組發病率最高，男女之比為2～3：1。發病率占胃腸道腫瘤的第3位。結腸癌主要為腺癌、黏液腺癌、未分化癌。大體形態呈息肉狀、潰瘍型等。結腸癌可沿腸壁環行發展，沿腸管縱徑上下蔓延或向腸壁深層浸潤，除經淋巴管、血流轉移和局部侵犯外，還可向腹腔內種植或沿縫線、切口面擴散轉移。慢性結腸炎患者、結腸息肉患者、男性肥胖者等為易感人群。

據世界衛生組織(WHO)統計，全球結直腸癌每年新發病例數約120萬，年死亡人數達60余萬。隨著靶向治療藥物表皮生長因子受體抑制劑(epidermal growth factorreceptor inhibitor，EGFRI)西妥昔單抗和帕尼單抗的問世，結直腸癌的治療進入靶向治療時代。而KRAS基因是影響腫瘤細胞對EGFRI響應性的重要預測性生物標志物。KRAS基因與CRC的關系密切，在CRC中的突變率為35％～45％。KRAS基因發生突變后，會導致表皮生長因子受體(EGFR)依賴的RASRAF-MAPK信號通路持續激活，引起細胞過度增殖和分化，從而誘發CRC。多個研究證實，腫瘤KRAS基因突變后對EGFRI(如西妥昔單抗、帕尼單抗)治療不敏感。美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)結直腸癌臨床實踐指南2008年版已經指出：所有轉移性結直腸癌患者均應進行KRAS基因檢測，僅對KRAS基因野生型患者推薦接受EGFRI治療。因此，臨床上將KRAS基因突變狀態作為一個重要的治療標志物，它與結直腸癌的預后和治療效果密切相關。

結腸癌發病的主要與高脂肪和低纖維素飲食有關。結腸的慢性炎癥使腸癌的發生率比一般人群高。有結腸息肉者，結腸癌發生率是無結腸息肉者的5倍。家族性多發性腸息肉瘤，癌變的發生率更高。遺傳因素可能也參與結腸癌的發病。

K-ras基因是公認的癌基因，在結腸癌突變率可達30～60％。約90％的K-ras基因突變發生在突變熱點2號外顯子12、13密碼子上，其密碼子12是發生突變的熱點位置。臨床上靶向新藥愛必妥(Erbitux)和帕尼單抗(Panitumumab)僅適用于無突變的K-ras基因野生型患者，對K-ras突變患者無效。因此，檢測K-ras基因突變對于指導結直腸癌患者的靶向治療具有重要意義。

傳統的K-ras基因突變檢測方法有三種：直接測序(例如聚合酶鏈式反應)、DNA雜交和限制酶分解方法(Botezatu,et al.,2017；Su,et al.,2017；Stancescu,et al.,2016)。基于光學、電化學、壓電利用互補DNA或肽核酸探針檢測特定靶核酸序列是目前檢測基因突變最流行的方法之一(Toren,et al.,2015)。然而，以上方法耗時，需標記和昂貴的設備。因此，亟待研究一種強大、高效、精準、快速的原位K-ras基因突變檢測新方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于固態納米孔結腸癌kras基因突變檢測方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種基于固態納米孔結腸癌kras基因突變檢測方法,包括以下步驟：