[發明專利]基于APN基因的小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的檢測方法及其試劑盒

有效

• 申請號: 201910684686.3
• 申請日: 2019-07-26
• 公開（公告）號: CN110616267B
• 公開（公告）日: 2022-08-19
• 發明（設計）人: 郭兆將;康師;周君雷;龔莉君;孫丹;覃艦瑩;郭樂;朱流紅;白楊;張竹竹;葉凡;張友軍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京知本村知識產權代理事務所(普通合伙) 11039
• 代理人: 劉江良

本發明公開了一種基于四個APN基因的小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的實時熒光定量PCR檢測方法及其試劑盒，該試劑盒包含特異引物序列：正、反向引物如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；或如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；或如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示；或如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示。本發明方法檢測周期短，檢測數量大，需人力及樣品量少，且靈敏度高、特異性強、準確可靠，能有效的檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac的抗性，適合于小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的早期快速診斷，可用于田間小菜蛾Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的實時監控和預警預報，應用前景廣泛。

技術領域

本發明涉及生物領域，涉及小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的實時熒光定量PCR檢測方法及其試劑盒。

背景技術

小菜蛾Plutella xylostella (L.)，屬于鱗翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，是一種十字花科蔬菜作物重要害蟲，廣泛分布于世界各地。小菜蛾主要以幼蟲取食寄主植物葉片造成危害，大大降低了蔬菜的產量和質量，個別田塊嚴重發生時可導致絕產。據報道，小菜蛾在全世界范圍內每年造成約40-50億美元的經濟損失。目前，田間防治小菜蛾的主要措施仍是葉面噴施殺蟲劑。但是小菜蛾繁殖力強和世代周期短的特點使其能對各種殺蟲劑快速進化產生抗藥性，其中包括生物源農藥蘇云金芽胞桿菌。

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis, Bt)屬于革蘭氏陽性桿狀細菌，它在產孢過程中能產生多種殺蟲蛋白從而高效專一的殺死不同靶標害蟲。Bt因其殺蟲譜廣、高效專一且對人畜環境無害成為世界上產量最大和用途最廣的微生物殺蟲劑，同時多個編碼Bt殺蟲蛋白的基因被轉入到多種重要經濟作物中。多年來，Bt制劑和Bt作物在害蟲防治和環境保護中發揮了極其重要的作用。但是Bt的大量和不合理應用導致了害蟲對Bt產生抗性。目前在世界范圍內已有9種害蟲被報道在田間對Bt制劑或Bt作物產生抗性。其中，小菜蛾是世界上第一個被報道在田間產生Bt抗性的害蟲，加之小菜蛾基因組測序的完成和公布，使其成為害蟲Bt抗性分子機制研究的模式昆蟲。因此，小菜蛾Bt抗性機制的研究和抗性關鍵基因的鑒定為其抗藥性檢測、監測及預警提供理論支持，同時對Bt的可持續應用以及害蟲綜合治理具有重要的理論和實踐意義。

實時熒光定量PCR (Real Time-quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)，是在普通PCR反應體系中加入熒光染料或者探針，利用熒光信號對整個PCR反應擴增過程進行實時監測和連續分析，最終依據PCR擴增指數期熒光信號達到所設定閾值所需的循環數Ct值與該模板的起始拷貝數之間的線性關系對未知模板進行定量。目前實時熒光定量PCR不僅廣泛應用于基礎科學研究、疾病診斷以及食品檢疫等領域，同時在昆蟲Bt抗藥性靶標基因轉錄水平表達量的檢測中大規模應用。實時熒光定量PCR以其特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、操作簡便、高通量等優點，相較于周期長、靈敏度低、操作繁瑣的小菜蛾毒力生物測定等常規性檢測方法而言，在抗藥性檢測上顯示出強大的應用前景。