[發明專利]基于APN基因的小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的檢測方法及其試劑盒

有效

• 申請號: 201910684686.3
• 申請日: 2019-07-26
• 公開（公告）號: CN110616267B
• 公開（公告）日: 2022-08-19
• 發明（設計）人: 郭兆將;康師;周君雷;龔莉君;孫丹;覃艦瑩;郭樂;朱流紅;白楊;張竹竹;葉凡;張友軍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京知本村知識產權代理事務所(普通合伙) 11039
• 代理人: 劉江良

1.一種檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的PCR檢測方法，其特征在于：具體包括以下步驟：

(1)提取待測小菜蛾4齡幼蟲中腸的RNA樣品，并反轉錄為cDNA模板；

(2)將所述cDNA模板加入到含有特異性引物對的PCR反應液中得到PCR反應體系；所述特異性引物對是以小菜蛾APN6基因為靶目標序列設計得到的靶標基因特異性引物對，所述特異性引物對由如SEQ ID NO. 11所示的正向引物和如SEQ ID NO. 12所示的反向引物組成；

(3)進行實時熒光定量PCR檢測；

對于APN6基因，若所述待測小菜蛾的樣品產生典型的“S”型擴增曲線及單峰熔解曲線，且△Ct值≤1，則說明所述小菜蛾待測樣品對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac產生抗性；若△Ct值≥2，則說明待測小菜蛾待測樣品未對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac產生抗性；其中，△Ct值就是靶標APN基因與內參基因RPL32之間的Ct值的差值。

2.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于：所述實時熒光定量PCR檢測的擴增程序為：95℃預變性15min，95℃變性15sec，53℃退火30sec，72℃延伸32 sec，40個循環。

3.如權利要求2所述的檢測方法，其中，PCR過程完成后，按0.1℃?s^-1的升溫速率從72℃升至95℃進行熔解曲線的分析驗證，具體過程為：95℃進行15s，然后60℃進行1min，95℃進行30s，最后60℃進行15s。