[發明專利]一種構建高產谷胱甘肽重組菌株的方法及應用

在審

• 申請號: 201910680780.1
• 申請日: 2019-07-26
• 公開（公告）號: CN112301050A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 徐志南;劉偉;黃磊;連佳長;蔡謹
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/77
• 分類號: C12N15/77;C12N15/31;C12P21/02
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春

1.一種構建高產谷胱甘肽重組菌株的方法，其特征為以任一可以合成谷氨酸的谷氨酸合成菌株，通過引入外源谷胱甘肽合成基因gshF或gshA和gshB基因，構建谷胱甘肽合成菌；強化該重組菌中半胱氨酸代謝途徑，構建無需外源半胱氨酸與谷氨酸添加的谷胱甘肽高產菌株。

2.根據權利要求1所述的一種構建高產谷胱甘肽重組菌株的方法，其特征在于谷胱甘肽合成途徑的引入通過質粒上過表達來源無乳鏈球菌的gshF基因或來源大腸桿菌的gshA和gshB基因實現。

3.根據權利要求1所述的一種構建高產谷胱甘肽重組菌株的方法，其特征在于半胱氨酸合成途徑強化方法包括半胱氨酸降解途徑和半胱氨酸合成前體絲氨酸降解途徑的阻斷、半胱氨酸合成抑制因子的敲除以及半胱氨酸與半胱氨酸合成前體絲氨酸合成途徑的強化。

4.根據權利要求3所述的一種構建高產谷胱甘肽重組菌株的方法，其特征在于半胱氨酸降解途徑和半胱氨酸合成前體絲氨酸降解途徑的阻斷、半胱氨酸合成抑制因子的敲除以及半胱氨酸與半胱氨酸合成前體絲氨酸合成途徑的強化具體包括相關代謝途徑基因的單一或組合改造。

5.根據權利要求4所述的一種構建高產谷胱甘肽重組菌株的方法，其特征在于相關代謝途徑基因的單一或組合改造，包括半胱氨酸降解途徑基因aecD的敲除，半胱氨酸合成前體絲氨酸降解途徑基因sdaA敲入來源大腸桿菌半胱氨酸合成途徑基因cysE和cysk，半胱氨酸合成抑制因子mcbR基因的敲除，來源擬南芥的對半胱氨酸濃度不敏感的cysE基因質粒過表達，以及半胱氨酸合成前體絲氨酸合成途徑中來源谷氨酸棒桿菌的對絲氨酸脫敏的截短serA基因與pgk基因的質粒過表達。

6.根據權利要求1所述的一種構建高產谷胱甘肽重組菌株的方法，其特征在于任一可以合成谷氨酸的谷氨酸合成菌株，包括谷氨酸棒桿菌ATCC13032，谷氨酸棒桿菌B253，谷氨酸棒桿菌R，谷氨酸棒桿菌CGMCC 1.15647，谷氨酸棒桿菌CCTCC AB 93110，谷氨酸棒桿菌CCTCC AB 2013340。

7.權利要求1所述的構建高產谷胱甘肽重組菌株的應用，其特征在于鑒于谷氨酸棒桿菌自身可以合成大量谷氨酸，半胱氨酸途徑已被強化，發酵過程中僅需添加甘氨酸即可高產谷胱甘肽。

8.用權利要求1所述高產谷胱甘肽重組菌株生產谷胱甘肽的方法，其特征在于：挑取活化過的單菌落于1～100mL種子培養基，25～37℃、50～500rpm培養5～30h，按0.1～30％接種量轉接1～500mL種子培養基，25～37℃、50～500rpm培養5～30h，然后按初始OD₆₀₀為0.1～3轉至1～10L/3～50L發酵罐；通過流加氨水調節pH至5.0～8.0，通過控制轉速和曝氣率控制溶氧為10～50％；對數前期添加0～100mM甘氨酸，對數中期添加0～100mM甘氨酸和0～20g/L硫代硫酸鈉；谷胱甘肽產量可達50～2000mg/L。

種子培養基：1～20g/L葡萄糖，0.5～2g/L酵母提取物，1～5g/L蛋白胨，1～3g/L(NH₄)₂SO₄，0.1～1g/L K₂HPO₄，0.1～1g/L KH₂PO₄；

發酵培養基：1～40g/L葡萄糖，0.5～2g/L酵母提取物，1～7g/L蛋白胨，1～7g/L(NH₄)₂SO₄，0.1～1g/L K₂HPO₄，0.1～1g/L KH₂PO₄，0.1～1g/L MgSO₄·7H₂O，1～10mg/L FeSO₄·7H₂O，1～10mg/L MnSO₄·H₂O，0～10mg/L生物素，0～10mg/L硫胺素。