[發明專利]一種構建高產谷胱甘肽重組菌株的方法及應用

在審

• 申請號: 201910680780.1
• 申請日: 2019-07-26
• 公開（公告）號: CN112301050A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 徐志南;劉偉;黃磊;連佳長;蔡謹
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/77
• 分類號: C12N15/77;C12N15/31;C12P21/02
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春

一種構建高產谷胱甘肽重組菌株的方法與應用，屬于生物工程領域。本發明提供的高產谷胱甘肽的重組菌株方法的特征在于：以自身大量合成谷氨酸的谷氨酸棒桿菌為出發菌株，引入來源無乳鏈球菌的gshF基因或來源大腸桿菌的gshA和gshB基因賦予谷胱甘肽合成能力；進一步基因組缺失基因aceD，mcbR和sdaA；同時表達截短的serA基因，pgk基因，來源大腸桿菌的cysE基因和cysK基因，來源擬南芥的cysE基因，強化半胱氨酸途徑；鑒于谷氨酸棒桿菌株自身可以合成大量谷氨酸，半胱氨酸途徑已被強化，獲得的工程菌發酵過程中僅需添加甘氨酸即可高產谷胱甘肽。

技術領域

一種構建高產谷胱甘肽重組菌株的方法與應用，屬于生物工程領域，具體涉及一種高產谷胱甘肽的方法。

技術背景

迄今為止，谷胱甘肽(GSH)主要通過微生物發酵合成。鑒于野生菌中GSH產量低，基因工程和代謝工程的手段被廣泛應用釀酒酵母，巴斯德畢赤酵母，產朊假絲酵母和大腸桿菌等發酵宿主中強化GSH的合成。然而均需要添加三種前體氨基酸達到高產GSH的目的。谷氨酸棒桿菌屬由于可以自身大量合成谷氨酸，以其作為宿主，可以免去GSH合成前體谷氨酸的添加。此外，作為GSH另一必需前體，半胱氨酸價格相對昂貴，并且作為底物添加時易被氧化。在谷氨酸棒桿菌中，由基因cysE編碼的絲氨酸乙酰轉移酶和由基因cysK編碼的半胱氨酸合成酶可以催化L-絲氨酸向半胱氨酸的轉化，且據報道，經過代謝改造，絲氨酸合成可達30-43g/L。因此，可以通過嘗試強化絲氨酸和半胱氨酸途徑達到谷氨酸棒桿菌合成GSH過程中不添加或少添加L-半胱氨酸的目的。

發明內容

本發明的第一個目的在于提供一種構建高產谷胱甘肽重組菌株的方法。為此，本發明采用以下技術方案：

一種構建高產谷胱甘肽重組菌株的方法，其特征為以任一可以合成谷氨酸的谷氨酸合成菌株，通過引入外源谷胱甘肽合成基因gshF或gshA和gshB基因，構建谷胱甘肽合成菌；強化該重組菌中半胱氨酸代謝途徑，構建無需外源半胱氨酸與谷氨酸添加的谷胱甘肽高產菌株。

進一步地，谷胱甘肽合成途徑的引入通過質粒上過表達來源無乳鏈球菌的gshF基因或來源大腸桿菌的gshA和gshB基因實現。

進一步地，半胱氨酸合成途徑強化方法包括半胱氨酸降解途徑和半胱氨酸合成前體絲氨酸降解途徑的阻斷、半胱氨酸合成抑制因子的敲除以及半胱氨酸與半胱氨酸合成前體絲氨酸合成途徑的強化。

進一步地，半胱氨酸降解途徑和半胱氨酸合成前體絲氨酸降解途徑的阻斷、半胱氨酸合成抑制因子的敲除以及半胱氨酸與半胱氨酸合成前體絲氨酸合成途徑的強化具體包括相關代謝途徑基因的單一或組合改造。

進一步地，相關代謝途徑基因的單一或組合改造，包括半胱氨酸降解途徑基因aecD的敲除，半胱氨酸合成前體絲氨酸降解途徑基因sdaA敲入來源大腸桿菌半胱氨酸合成途徑基因cysE和cysk，半胱氨酸合成抑制因子mcbR基因的敲除，來源擬南芥的對半胱氨酸濃度不敏感的cysE基因質粒過表達，以及半胱氨酸合成前體絲氨酸合成途徑中來源谷氨酸棒桿菌的對絲氨酸脫敏的截短serA基因與pgk基因的質粒過表達。

進一步地，任一可以合成谷氨酸的谷氨酸合成菌株，包括谷氨酸棒桿菌ATCC13032，谷氨酸棒桿菌B253，谷氨酸棒桿菌R，谷氨酸棒桿菌CGMCC 1.15647，谷氨酸棒桿菌CCTCC AB 93110，谷氨酸棒桿菌CCTCC AB 2013340。

本發明還提供了所述的構建高產谷胱甘肽重組菌株的應用，鑒于谷氨酸棒桿菌自身可以合成大量谷氨酸，半胱氨酸途徑已被強化，發酵過程中僅需添加甘氨酸即可高產谷胱甘肽。