[發明專利]一種利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘對潰瘍病抗性的方法

有效

• 申請號: 201910676561.6
• 申請日: 2019-07-25
• 公開（公告）號: CN110283824B
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發明（設計）人: 李強;何永睿;陳善春;鄒修平;龍琴
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;C12N15/66;C12N15/65;A01H5/00;A01H6/78
• 代理公司: 成都行之專利代理事務所(普通合伙) 51220
• 代理人: 李英

本發明公開了一種利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘對潰瘍病抗性的方法，屬于分子生物學領域，包括以下步驟：(1)克隆柑橘CsXTH04基因片段，然后進行干擾表達載體構建；(2)干擾表達載體轉化柑橘，得到轉基因植株。該方法能夠顯著提高柑橘對潰瘍病的抗性。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘對潰瘍病抗性的方法。

背景技術

柑橘是我國南方重要的果樹作物，因其具有較高的食用價值和藥用價值而受到人們的喜愛。柑橘是全球重要經濟作物，主要種植在非洲(16.60％)，亞洲(52.90％)、美洲(24.50％)、歐洲和大洋洲(6％)(魏方林等，2008)。然而柑橘產業發展卻飽受各種病害的困擾，其中柑橘潰瘍病(Citrus bacterial canker，CBC)是阻礙柑橘產業發展最為嚴重的病害之一(胡軍華等，2015)。我國廣東、廣西、福建、湖南等柑橘主產區受柑橘潰瘍病侵害較為嚴重。全世界有30多個國家和地區將柑橘潰瘍病列為重要的植物檢疫對象。柑橘潰瘍病是由黃單胞桿菌柑橘致病變種(Xanthomonas citri subsp.citri，Xcc)引起，起源于印度、爪哇等地(Pitino et al，2015)。潰瘍病菌主要侵染柑橘葉片、枝梢、果實等，其中苗木、幼樹受害較為嚴重。病樹會出現落葉、枯梢、樹勢衰弱以及落果等現象，嚴重的影響了柑橘的產量和品質。病樹的葉片發病初期表層出現濃黃色小圓斑，后期病變成淡褐色或褐色，最終形成火山口狀灰白色凸起(何秀玲等，2007)。

目前為控制柑橘潰瘍病危害通常采取化學防治為主，生物防治為輔的綜合防治策略。由于以上防治措施對環境不友好，且需要投入大量的人力、物力，亟待通過培育抗病新品種來減少潰瘍病帶來的損失(陳力等，2008；朱雪梅等，2017)。在抗病育種方面一代代柑橘人進行了長期雜交育種，但由于雜交育種周期長使得育種效率低。隨著分子生物學的興起，人們開始從抗病基因工程方向對病原菌本身和植物的抗病防衛反應進行研究。基因工程手段也在抗潰瘍病研究中進行了嘗試，獲得了一些對潰瘍病有抗性的轉基因材料(賈瑞瑞等，2017；段敏杰等，2016)。陳善春等獲得了對柑橘潰瘍病有抗性的轉柞蠶抗菌肽D基因的錦橙、新會橙、臍橙植株(陳善春等，1996)。外源基因NLS，chit42，Xa21和PthA在轉移至冰糖橙，椪柑和甜橙后對柑橘潰瘍病具有抗性(Mendes et al，2010；Yang et al，2011)。賈瑞瑞的研究發現CsBZIP40是響應柑橘潰瘍病侵染的一個重要的轉錄因子，并且猜測是通過SA途徑影響柑橘品種的抗性(賈瑞瑞等，2017)。CsLOB1基因作為潰瘍病病原基因PthA的靶蛋白，被認為是是柑橘潰瘍菌的感病因子，使得植物對潰瘍病更為敏感(Li et al，2014)。Fuqua等發現由N-?；呓z氨酸內酯(AHL)可作為誘導細菌群體感應系統的信號分子，并且參與到各種病原體的發病機制中(Fuqua et al，1994；Withers et al，2001)，之后他們將細菌中的水解酶轉基因進入植物，發現植物對潰瘍病的抵抗力更強(Zan et al，2011)。近年來，出現了使用基因敲除技術來防御潰瘍病病原菌的方法，彭愛紅等對柑橘潰瘍病感病基因CsLOB1啟動子進行CRISPR/Cas9靶向敲除從而獲得了對柑橘潰瘍病抗性提高的植株(Peng et al，2017)。