[發明專利]一種利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘對潰瘍病抗性的方法

有效

• 申請號: 201910676561.6
• 申請日: 2019-07-25
• 公開（公告）號: CN110283824B
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發明（設計）人: 李強;何永睿;陳善春;鄒修平;龍琴
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;C12N15/66;C12N15/65;A01H5/00;A01H6/78
• 代理公司: 成都行之專利代理事務所(普通合伙) 51220
• 代理人: 李英

1.一種利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘對潰瘍病抗性的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）克隆柑橘CsXTH04基因片段，然后進行干擾表達載體構建；

（2）干擾表達載體轉化柑橘，得到轉基因植株；

CsXTH04的CDS的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。

2.根據權利要求1所述的一種利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘對潰瘍病抗性的方法，其特征在于，步驟（1）中，克隆CsXTH04基因片段所采用的引物為RNAi-CsXTH04-F和RNAi-CsXTH04-R，分別具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列。

3.根據權利要求1所述的一種利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘對潰瘍病抗性的方法，其特征在于，步驟（1）中，柑橘CsXTH04基因片段的克隆方法為：提取柑橘總RNA，然后反轉錄為cDNA，最后采用高保真酶PCR擴增得到CsXTH04基因片段。

4.根據權利要求1所述的一種利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘對潰瘍病抗性的方法，其特征在于，步驟（1）中，干擾表達載體構建方法為：根據CsXTH04編碼序列設計上游分別含有XbaⅠ、SwaⅠ酶切位點和保護堿基的特異引物，下游分別含有BamHⅠ、AscⅠ酶切位點和保護堿基的特異引物，以cDNA為模板進行PCR擴增得到干擾片段，片段序列如SEQ ID NO：3所示；將產物回收后分兩組，第一組用SwaⅠ和AscⅠ雙酶切，第二組用BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切，酶切回收的兩組片段同時連接到pUCr干擾載體的相應部位上，得到中間載體pUCr-CsXTH04-RNAi進行測序驗證，然后將測序正確的產物和pLGNe超量表達載體用KpnⅠ和SalⅠ分別雙酶切，將含有干擾片段的酶切產物連接到pLGNe表達載體上，構建出最終的干擾表達載體pLGNe-CsXTH04-RNAi。

5.根據權利要求4所述的一種利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘對潰瘍病抗性的方法，其特征在于，pLGNe載體帶有CaMV 35S啟動子和GUS編碼基因，CaMV 35S啟動子為花菜花葉病毒啟動子，GUS用作轉基因植株檢測，分別具有SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

6.根據權利要求1所述的一種利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘對潰瘍病抗性的方法，其特征在于，步驟（2）中，干擾表達載體轉化柑橘的方法為：干擾表達載體通過電擊法轉化農桿菌，再用農桿菌介導轉化柑橘外植體，遺傳轉化后的外植體細胞再經離體培養、染色鑒定、嫁接后得到轉基因植株。

7.根據權利要求1所述的一種利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘對潰瘍病抗性的方法，其特征在于，步驟（2）得到轉基因植株后，對轉基因植株進行抗性評價，判定CsXTH04基因沉默與柑橘潰瘍病的相關性。

8.根據權利要求7所述的一種利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘對潰瘍病抗性的方法，其特征在于，對轉基因植株進行抗性評價前，通過PCR驗證轉基因植株，采用的引物為ID-CsXTH04-F和ID-CsXTH04-R，分別具有如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示核苷酸序列。

9.根據權利要求8所述的一種利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘對潰瘍病抗性的方法，其特征在于，PCR驗證后，用qRT-PCR再次驗證轉基因植株，采用的引物為RT-CsXTH04-F和RT-CsXTH04-R，分別具有如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示核苷酸序列；qRT-PCR內參為柑橘Actin基因，采用引物為RT-CsActin-F和RT-CsActin-R，分別具有如SEQ ID NO：10和SEQID NO：11所示核苷酸序列。