[發明專利]一種大麥小孢子的取材方法

有效

• 申請號: 201910673875.0
• 申請日: 2019-07-24
• 公開（公告）號: CN110317772B
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 郭桂梅;何婷;李穎波;陳志偉;陸瑞菊;劉成洪
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 張曉敏;費開逵

一種大麥小孢子的取材方法，包括：1)幼穗取材及預處理；2)收集、純化小孢子。本發明在幼穗取材時，通過控制旗葉與倒二葉葉舌的間距為1.1?2.0cm，縮小小孢子培養中的誘導分化差異，分離獲得的小孢子經培養后誘導成胚率高，分化綠苗能力強，小孢子培養再生的效率提高了3倍，大大降低了小孢子培養中對人工及設備的要求，且能做到量化取材標準，可以提高取材的效率和標準的實用性。

技術領域

本發明屬于農業生物技術領域，具體涉及一種大麥小孢子的取材方法。

背景技術

小孢子具有單細胞和單倍體的特性，是細胞工程遺傳育種、遺傳轉化的理想受體，也是研究胚胎發生機理的理想對象。游離小孢子培養是獲得純合加倍單倍體的有效途徑，游離小孢子培養技術是目前研究的熱點之一，要使游離小孢子培養能夠順利進行，取材至關重要。

大麥小孢子培養取材多采用鏡檢方法，對取得的幼穗剝離，挑取花藥，搗碎，在顯微鏡下鏡檢，觀察小孢子的發育時期來確定合適的取材時期，選擇最適宜啟動小孢子離體胚胎發育的時期來達到高效培養再生的目的。

但是，小孢子發育是連續的、復雜的，存在多態性，需要用合適發育時期的比例來定，而對于小孢子發育時期比例的判定標準還存在難度和差異。

前期研究有報道根據花藥顏色來決定取材時期，但對于花藥顏色的辨別也會因人而異，且對取材人的技術要求較高，不能夠推廣應用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種大麥小孢子的取材方法，確定合適的取材旗葉間距，分離獲得的小孢子經培養后愈傷組織產量增加30％左右，獲得的愈傷組織易誘導成胚，分化綠苗能力強，再生效率提高了3倍，縮小小孢子培養中的誘導分化差異，提高大麥小孢子培養中的取材效率及取材標準的實用性，提高生產效益。

為了達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種大麥小孢子的取材方法，包括如下步驟：

1)幼穗取材及預處理

取旗葉與倒二葉葉舌的間距為1.1-2.0cm的大麥幼穗，保留幼穗上部兩片葉子下的基部1.0-1.5cm，置于2-10℃環境中低溫預處理10-30天；

2)收集、純化小孢子

對幼穗進行消毒，將花苞接種至試管中，添加10-15ml提取液，旋切，過濾；濾液以400-1000r·min^-1速度，離心3-7min，重復1-4次，收集小孢子；

收集到的小孢子用提取液于23-28℃，黑暗中預處理1-3天后，再用20-22％麥芽糖純化，將死活細胞分開，收集活的小孢子；

其中，所述的提取液中含有甘露醇50-70g·L^-1，添加CaCl₂ 0.8-1.5g·L^-1、N-嗎啡乙烷磺酸0.8-1.1g·L^-1和秋水仙堿5-25mg·L^-1，pH 5.6-6.0。

優選地，所述步驟1)中，將選取的幼穗置于2-5℃環境中低溫預處理。

又，所述步驟1)中，將選取的幼穗低溫預處理21-30天。

進一步，步驟2)中，將花苞接種至提取液中后放置于0-5℃處理1-2天后再旋切。

又，步驟2)中，將收集到的小孢子用提取液于23-25℃、黑暗中預處理2天。

優選地，步驟2)中，所述麥芽糖的濃度為21％。