[發(fā)明專利]用于生產(chǎn)光學(xué)純1,3-丁二醇的重組菌及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910664906.6
• 申請日: 2019-07-23
• 公開（公告）號: CN112280722B
• 公開（公告）日: 2022-03-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳振;劉德華;劉煜
• 申請（專利權(quán)）人: 清華大學(xué);廣東清大智興生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/18;C12N9/02;C12R1/19
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)光學(xué)純1,3?丁二醇的重組菌及其應(yīng)用。所述重組菌是將phaA、phaB、bld和yqhD基因通過質(zhì)粒導(dǎo)入微生物中或通過基因工程手段整合到微生物染色體上而成。利用本發(fā)明的大腸桿菌工程菌在微氧的條件下發(fā)酵廉價有機(jī)碳源如葡萄糖、蔗糖或甘油等，1,3?丁二醇相對于底物的得率可以達(dá)到0.4g/g以上，且R型1,3?丁二醇純度達(dá)到99％以上，具有重要的工業(yè)應(yīng)用潛力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種用于生產(chǎn)光學(xué)純1,3-丁二醇的重組菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

1,3-丁二醇是一種具有重要工業(yè)應(yīng)用價值的二元醇，其可以被用作化妝品的溶劑，同時可以用作單體來合成聚酯、聚氨酯及生物增塑劑。同時光學(xué)純的1,3-丁二醇可以用作醫(yī)藥中間體來合成許多藥物。但是化學(xué)法合成的1,3-丁二醇都是外消旋體，無法直接用作醫(yī)藥中間體。因此，利用生物法生產(chǎn)光學(xué)純1,3-丁二醇具有重要應(yīng)用價值。

CN201610481598.X和CN201080029715.X分別公開了兩種1,3-丁二醇的生產(chǎn)方法，其主要是在厭氧條件下表達(dá)至少一種編碼以足夠的量表達(dá)的1,3-BDO通路酶的外源性核酸，以生產(chǎn)1,3-丁二醇。但該過程的生產(chǎn)效率低，1,3-丁二醇的最高產(chǎn)量低于2mM，不具有工業(yè)可行性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于生產(chǎn)光學(xué)純1,3-丁二醇的重組菌及其應(yīng)用。

本發(fā)明構(gòu)思如下：提供一種重組大腸桿菌，其是通過上調(diào)大腸桿菌的pntAB基因并同時下調(diào)sthA基因從而極大提高細(xì)胞內(nèi)的NADPH基因以滿足1,3-丁二醇合成途徑所需要的還原力NADPH，從而提高1,3-丁二醇的產(chǎn)量。本發(fā)明同時通過酶的設(shè)計構(gòu)建了Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum的丁醛脫氫酶突變體，其是將丁醛脫氫酶第273位亮氨酸突變?yōu)樘K氨酸而成，在大腸桿菌中表達(dá)該突變體可以極大提高1,3-丁二醇的產(chǎn)量。本發(fā)明同時通過敲除adhE基因，ldhA基因，pta基因，ackA基因提高了乙酰-CoA流向1,3-丁二醇合成途徑的代謝通量，進(jìn)一步提高了1,3-丁二醇的產(chǎn)量。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，第一方面，本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)光學(xué)純1,3-丁二醇的重組菌，所述重組菌是將phaA、phaB、bld和yqhD基因通過質(zhì)粒導(dǎo)入微生物中或通過基因工程手段整合到微生物染色體上而成。

其中，所述phaA基因為乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶基因，來源于Cupriavidus necator，其為編碼如下蛋白質(zhì)(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(b)SEQ ID NO:3所示序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。

所述phaB基因為3-氧酰基-(酰基載體蛋白)還原酶基因，來源于Cupriavidusnecator，其為編碼如下蛋白質(zhì)(c)或(d)的基因：

(c)由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(d)SEQ ID NO:4所示序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等功能的由(c)衍生的蛋白質(zhì)。

所述bld基因來源于Clostridium saccharoperbutylacetonicum，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示。

所述yqhD基因為醇脫氫酶基因，來源于大腸桿菌(Escherichia coli)，其為編碼如下蛋白質(zhì)(e)或(f)的基因：

(e)由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(f)SEQ ID NO:6所示序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等功能的由(e)衍生的蛋白質(zhì)。