[發(fā)明專利]用于生產光學純1,3-丁二醇的重組菌及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910664906.6
• 申請日: 2019-07-23
• 公開（公告）號: CN112280722B
• 公開（公告）日: 2022-03-08
• 發(fā)明（設計）人: 陳振;劉德華;劉煜
• 申請（專利權）人: 清華大學;廣東清大智興生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/18;C12N9/02;C12R1/19
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

1.用于生產光學純1,3-丁二醇的重組大腸桿菌，其特征在于，所述重組大腸桿菌是以用于生產光學純1,3-丁二醇的重組菌作為出發(fā)菌株，利用基因工程手段對出發(fā)菌株進行改造，得到的細胞內NADPH供給增強的工程菌；

（1）通過增強出發(fā)菌株中與NADPH生物合成途徑相關的基因，來提高細胞內NADPH的供給；所述與NADPH生物合成途徑相關的基因為pntAB基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；以及

（2）通過弱化出發(fā)菌株中sthA基因，來提高細胞內NADPH的供給；所述弱化包括敲除或降低基因的表達；sthA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

所述用于生產光學純1,3-丁二醇的重組菌是將phaA、phaB、bld和yqhD基因通過質粒導入大腸桿菌中或通過基因工程手段整合到大腸桿菌染色體上而成；

其中，所述phaA基因來源于Cupriavidus necator，其為編碼如SEQ ID NO:3所示蛋白質的基因：

所述phaB基因來源于Cupriavidus necator，其為編碼如SEQ ID NO:4所示蛋白質的基因：

所述bld基因為丁醛脫氫酶突變體的編碼基因，來源于Clostridium saccharoperbutylacetonicum，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；

所述yqhD基因來源于大腸桿菌（Escherichia coli），其為編碼如SEQ ID NO:6所示蛋白質的基因。

2.根據權利要求1所述的重組大腸桿菌，其特征在于，用于生產光學純1,3-丁二醇的重組菌的構建如下：phaA、phaB基因經密碼子優(yōu)化后，與bld、yqhD基因一起構建到表達載體上，用重組載體轉化大腸桿菌，篩選陽性轉化子；

其中，密碼子優(yōu)化的phaA-phaB操縱子的序列如SEQ ID NO:5所示。

3.根據權利要求2所述的重組大腸桿菌，其特征在于，用于生產光學純1,3-丁二醇的重組菌的構建如下：將bld-yqhD-phaAB串聯(lián)基因表達盒構建到ptrc99a質粒上，用重組質粒轉化大腸桿菌，篩選陽性轉化子；

其中，bld-yqhD-phaAB串聯(lián)基因表達盒的序列如SEQ ID NO:9和10所示。

4.高產1,3-丁二醇的工程菌，其特征在于，所述工程菌是以權利要求1-3任一項所述的重組大腸桿菌作為原始菌株，利用基因工程手段對原始菌株做進一步改造，得到的細胞內乙酰CoA流向1,3-丁二醇合成途徑的代謝通量增強的工程菌；

弱化原始菌株中adhE、ldhA、pta、ackA基因中的至少一種基因，來提高細胞內乙酰CoA流向1,3-丁二醇合成途徑的代謝通量；所述弱化包括敲除或降低基因的表達；

adhE、ldhA、pta、ackA基因編碼蛋白的氨基酸序列分別如SEQ ID NO:11-14所示。

5.根據權利要求4所述的工程菌，其特征在于，弱化原始菌株中adhE、ldhA、pta和ackA基因，來提高細胞內乙酰CoA流向1,3-丁二醇合成途徑的代謝通量。

6.權利要求1-3任一項所述的重組大腸桿菌，或者權利要求4或5所述的工程菌在發(fā)酵生產1,3-丁二醇中的應用。

7.丁醛脫氫酶突變體，其特征在于，所述丁醛脫氫酶突變體的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。