[發(fā)明專利]一種有效促進(jìn)蒙古櫟球形胚發(fā)生的體細(xì)胞培養(yǎng)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910659088.0
• 申請(qǐng)日: 2019-07-22
• 公開（公告）號(hào): CN110235785B
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陸秀君;李前;張麗杰;梅梅;張曉林;王傲;艾萬峰;戰(zhàn)昊;韓曉義;李美瑩;金子涵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 北京君泊知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11496
• 代理人: 李丹

1.一種有效促進(jìn)蒙古櫟球形胚發(fā)生的體細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟：

（1）葉片外植體的選擇及處理：將從健康成年蒙古櫟母樹上采集的無蟲害的蒙古櫟種子在室內(nèi)播種于草炭土基質(zhì)中培養(yǎng)，待幼苗出土后，從苗齡70-75d 蒙古櫟幼苗頂端第一輪生點(diǎn)采集幼嫩葉片，將采集的所述幼嫩葉片置于流水下清洗1h后移至無菌工作臺(tái)；

（2）外植體消毒：將經(jīng)過步驟（1）處理后的所述幼嫩葉片用75%酒精消毒30s，無菌水漂洗3次，然后用0.1%升汞消毒4min，無菌水漂洗3-5次，之后用無菌濾紙吸干所述幼嫩葉片表面的水珠，獲得無菌葉片；

（3）接種：用解剖刀在靠近所述無菌葉片先端處將所述無菌葉片切割成長方形小塊，大小為1.5cm×1cm；之后將所述長方形小塊葉背朝下、葉面朝上接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；接種5天后將所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長的外植體在無菌條件下轉(zhuǎn)接到相同的新鮮愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中以防止褐變，之后繼續(xù)培養(yǎng)2周后，外植體存活率達(dá)65.3%；

（4）愈傷組織的誘導(dǎo)：將步驟（3）中存活的外植體接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，培養(yǎng)2周左右在葉片切口、中脈部位發(fā)生輕微的愈傷組織化，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)96.7%；所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成為MS+0.5mg/L2,4-D＋0.5mg/L6-BA+30g/L蔗糖+0.5g/L水解酪蛋白；所述愈傷組織誘導(dǎo)過程中控制環(huán)境溫度22±2℃，16h/d光照，光照強(qiáng)度2000lx；

（5）體胚誘導(dǎo)：將步驟（4）中獲得的帶有愈傷組織的外植體在無菌條件下轉(zhuǎn)接到體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)4-6周，得到體細(xì)胞胚胎，且體胚誘導(dǎo)率達(dá)50.0-58.0%；當(dāng)所述體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成為MS+0.1mg/L2,4-D＋0.5mg/L6-BA+30g/L蔗糖+0.5g/L水解酪蛋白時(shí)，誘導(dǎo)培養(yǎng)周期為4周，體胚誘導(dǎo)率可達(dá)58.0%；當(dāng)所述體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成為MS+0.5mg/LNAA＋0.5mg/L6-BA+30g/L蔗糖+0.5g/L水解酪蛋白時(shí)，誘導(dǎo)培養(yǎng)周期為6周，體胚誘導(dǎo)率可達(dá)50.0%。