[發明專利]一種有效促進蒙古櫟球形胚發生的體細胞培養方法

有效

• 申請號: 201910659088.0
• 申請日: 2019-07-22
• 公開（公告）號: CN110235785B
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 陸秀君;李前;張麗杰;梅梅;張曉林;王傲;艾萬峰;戰昊;韓曉義;李美瑩;金子涵
• 申請（專利權）人: 沈陽農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京君泊知識產權代理有限公司 11496
• 代理人: 李丹

本發明提供的一種有效促進蒙古櫟球形胚發生的體細胞培養方法，其特征在于，所述培養方法包括以下步驟：外植體的選擇及處理、外植體消毒、接種、愈傷組織的誘導、體胚誘導。本發明的有益效果在于：本發明提供的一種有效促進蒙古櫟球形胚發生的體細胞培養方法實現了較高的愈傷組織誘導率、體胚誘導率，獲得了細胞體積較小，細胞質致密濃厚，細胞核大且清晰的胚性愈傷組織；解決了蒙古櫟扦插生根困難、繁殖系數低、速度慢，無法形成規模化生產以滿足市場需求的難題，利用細胞的全能性，實現了在短期內大規模培育出優良植株的目的；為蒙古櫟無性繁殖體系的建立、工廠化育苗的實現提供了可能性。

技術領域

本發明屬于植物細胞培養技術領域，具體涉及一種有效促進蒙古櫟球形胚發生的體細胞培養方法。

背景技術

蒙古櫟(Quercus mongolica)是殼斗科(Fagaceae)櫟屬(Quercus)植物，又名蒙櫟、柞櫟、柞樹，屬落葉喬木。是中國國家二級珍貴樹種，也是中國東北林區中主要的次生林樹種。產于中國黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、河北等省區。俄羅斯、朝鮮、日本也有分布，世界多地有栽種。蒙古櫟因其樹形高大，可作園林園景樹或行道樹，樹形好者可為孤植樹做觀賞用。蒙古櫟種實營養價值很高，含淀粉55.79％，還含有多種氨基酸、胡蘿卜素、維生素等，其口感和營養價值遠高于目前市場上出售的淀粉制品，還可提取大量單寧，可用于止瀉止痢，具有很高的藥用價值。

由于蒙古櫟具有較高的觀賞價值、經濟價值以及重要的藥用價值，市場需求不斷擴大。然而由于蒙古櫟良種嚴重匱乏，且生長周期長，結實期晚，產量低，種子每3-5年出現一次大年，加之種子不耐貯藏，在收集和貯藏期間容易受到多種昆蟲侵害，這些特點都使得蒙古櫟種子園建立困難。扦插、嫁接等常規無性繁殖方式雖然能長期穩定地保持母本的優良性狀，但是蒙古櫟生根困難，繁殖系數低，速度慢，無法形成規模化生產，難以滿足市場的需求。

所以急需開發一種有效促進蒙古櫟球形胚發生的體細胞培養方法，利用細胞的全能性，從植物體分離出符合需要的組織、器官等，進行培養從而獲得再生植株，這樣既能保持其優良特性，又能不受季節限制的在短期內大規模培育出優良植株，為蒙古櫟無性繁殖體系的建立、工廠化育苗及基因工程等技術提供理論基礎和技術支持。

發明內容

為了彌補現有技術的不足，本發明提供了一種有效促進蒙古櫟球形胚發生的體細胞培養方法。

本發明提供的一種有效促進蒙古櫟球形胚發生的體細胞培養方法，包括以下步驟：

(1)外植體的選擇及處理：7月上旬，從健康已結實成年蒙古櫟母樹上采集無蟲害飽滿的種子，剝去所述種子的外部殼斗及果殼，在流水下清洗1h后移至無菌工作臺；

(2)外植體消毒：將經過步驟(1)處理后的所述種子用75％酒精消毒30s，無菌水漂洗3次，然后用0.1％升汞消毒12min，無菌水漂洗3-5次；在消毒及漂洗過程中，需要連續搖動瓶身并輕微攪拌，使所述種子與消毒液充分接觸，實現徹底消毒和漂洗；

(3)接種及愈傷組織誘導：用無菌解剖刀切除所述種子的合子胚子葉，得到去子葉合子胚，并將所述去子葉合子胚以下胚軸和胚根緊貼培養基的方式接種于愈傷組織誘導培養基上誘導愈傷組織，培養5天后將所述愈傷組織誘導培養基上生長的外植體在無菌條件下轉接到相同的新鮮的所述愈傷組織誘導培養基中，以防止褐變；之后繼續培養2周，外植體存活率為50.0％，此時發生輕微的愈傷組織化，獲得愈傷組織，所述愈傷組織生長健壯，呈白色顆粒狀，能長時間保持新鮮，可多次繼代增殖，愈傷組織誘導率達85.7％；

(4)體胚誘導：將在愈傷組織誘導培養基上培養3周后，獲得的白色顆粒狀愈傷組織接種于體胚誘導培養基上，誘導培養4周左右，得到體細胞胚胎，且體胚誘導率達72.3％。

作為一種優選的方案，步驟(3)中所述愈傷組織誘導培養基的組成為MS+1mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA+30g/L蔗糖+0.5g/L水解酪蛋白。