[發明專利]一種煙酸通過GPR109A受體應用于治療奶牛乳腺炎的實驗方法

有效

• 申請號: 201910655276.6
• 申請日: 2019-07-19
• 公開（公告）號: CN110376366B
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發明（設計）人: 柳巨雄;郭文晉;付守鵬;曹宇;闞興池
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50;G01N21/64;C12Q1/6876
• 代理公司: 北京棘龍知識產權代理有限公司 11740
• 代理人: 謝靜

1.一種煙酸通過GPR109A受體用于制備治療奶牛乳腺炎藥物的應用，其特征在于，包括以下步驟：

S1、乳腺炎奶牛的篩選：初步篩選出乳腺炎為陽性的奶牛，其體細胞數為80-200萬/mL；

S2、奶牛血清中促炎因子的檢測：分別在第0天和第7天收集正常奶牛、乳腺炎奶牛和飼喂煙酸的乳腺炎奶牛中的外周血，然后提取血液中的血清；

S3、奶牛乳汁中乳清的提取及促炎因子的檢測：分別在第0天和第7天收集正常奶牛、乳腺炎奶牛和飼喂煙酸的乳腺炎奶牛的乳汁，然后提取乳汁中的乳清，將采好的乳汁用3000轉的速度離心20分鐘，收集上清液并應用ELISA法檢測乳清中IL-6、TNF-α和IL-1β的蛋白表達；

S4、CCK8實驗

將原代奶牛乳腺上皮細胞接種到96孔細胞培養板中，每孔含有細胞0.5×10⁴個，加入培養基100μL，將細胞放入37℃和5％CO₂的無菌恒溫培養箱中培養24小時，然后加入不同濃度的煙酸或煙酸+LPS，待24小時后再次向每個孔中加入10μL的CCK8試劑，繼續在培養基中培養2小時，然后取出96孔板放入酶標儀中在450nm波長處測定吸光光度；

S5、煙酸對原代奶牛乳腺上皮細胞炎癥反應的抑制作用試驗

將0.3×10⁵個原代奶牛乳腺上皮細胞接種到60mm×15mm細胞培養皿中，分為4組：正常組、煙酸組、1μg/mlLPS組、LPS+煙酸組，當細胞數達到培養皿的80％時，用無血清培養基代替培養基培養3小時后加入煙酸，再過1小時后加入LPS，正常組不添加任何成分，煙酸組僅添加煙酸，1μg/mlLPS組僅添加1μg/ml LPS，LPS+煙酸組按照實驗步驟分別添加煙酸和LPS，3小時后收集培養皿中的原代奶牛乳腺上皮細胞，收集好的細胞用Trizol法提取總RNA并反轉錄成cDNA用于后續試驗或者提取細胞中的總蛋白并應用BCA蛋白濃度測定法測量細胞中的總蛋白含量，統一用于后續試驗，在后續試驗中利用熒光定量PCR法檢測原代乳腺上皮細胞中IL-6、TNF-α和IL-1β的基因表達，再利用western blot法檢測原代奶牛乳腺上皮細胞中COX2和INOS的蛋白表達；

S6、煙酸對GPR109A的激活作用

將0.3×10⁵個原代奶牛乳腺上皮細胞接種到60mm×15mm細胞培養皿中，分別用煙酸處理0h、1h、3h、6h和12h后收集細胞并提取細胞中的總蛋白，通過western blot的方法檢測細胞中GPR109A的表達量。

2.根據權利要求1所述的一種煙酸通過GPR109A受體用于制備治療奶牛乳腺炎藥物的應用，其特征在于：乳汁中體細胞數的檢測方法為：首先配制染色液，取40mL四氯乙烷和54mL乙醇，充分混合均勻，然后放置于65℃溫水溶液中進行3min加熱，再添加0.6g甲基藍，最后放置于溫度調整為4℃的冰箱中2小時，然后加入6mL冰醋酸，放于常溫保存；再取一塊干凈的載玻片，滴入10μL的生鮮乳樣品，放入恒溫箱中干燥，再浸入染色液中，最后形成均勻的玻片；將制備好的樣品放在計數板中進行染色細胞計數。

3.根據權利要求1所述的一種煙酸通過GPR109A受體用于制備治療奶牛乳腺炎藥物的應用，其特征在于：血液中血清的提取方法為：將步驟S2中采好的血液呈45度角放置于4℃冰箱中1小時，然后用3000轉的速度離心5分鐘，收集上清液并應用ELISA法檢測血清中IL-6、TNF-α和IL-1β的蛋白表達。

4.根據權利要求1所述的一種煙酸通過GPR109A受體用于制備治療奶牛乳腺炎藥物的應用，其特征在于：乳腺上皮細胞總蛋白的提取方法：利用蛋白提取試劑收集原代乳腺上皮細胞并提取總蛋白，應用western blot的方法檢測奶牛乳腺上皮細胞中iNOS、COX-2和GPR109A的相對表達量。