[發明專利]一種表達BVDV-E0的重組牛腸道病毒的構建方法與初步應用

有效

• 申請號: 201910654523.0
• 申請日: 2019-07-19
• 公開（公告）號: CN110452889B
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發明（設計）人: 侯紹華;任肖;賈紅;張姍;姜一曈
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/66;C12R1/93
• 代理公司: 北京德崇智捷知識產權代理有限公司 11467
• 代理人: 董柏雷

本發明公開了一種表達BVDV?E⁰的重組牛腸道病毒的構建方法及其初步應用，所述感染性克隆毒株是通過反向遺傳操作的方法獲得BEV BJ101毒株的全長cDNA克隆并獲得拯救毒株rBEV后，將BVDV的E0序列插入到BEV全長cDNA中，獲得可穩定表達外源基因E0的重組牛腸道病毒。所述rBEV?E0重組病毒的初步應用，將分離純化后的重組病毒免疫6～8周齡的SPF級別的Balb/c雌鼠，在不同時間點收集其血清樣本進行檢測，小鼠不但可以穩定表達E0蛋白，并能對其產生有效的免疫應答。本發明的重組病毒可同時用于BEV和BVDV的防控，也為其他外源基因提供了合適的的rBEV插入位點，為后續外源基因的插入、重組病毒的制備等研究提供有效的技術平臺。

技術領域

本發明屬于獸用生物制品技術領域，涉及一種重組牛腸道病毒，尤其涉及一種表達BVDV-E⁰的重組牛腸道病毒(表達牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)E0蛋白)的構建方法及其初步應用。

背景技術

20世紀50年代首次從牛體內分離到BEV，隨后在負鼠、寬吻海豚、駱駝和羊駝等動物體內也分離到該病毒。BEV的病原性不明顯，感染宿主后引起腹瀉、呼吸困難和繁殖障礙。BEV為單股正鏈RNA病毒，屬于腸病毒屬，小RNA病毒科。腸道病毒屬共12種型，BEV屬于腸道病毒E型或F型。BEV基因組大小約7500bp，基因組包含5’非編碼區、ORF、3’非編碼，ORF編碼結構蛋白(P1區編碼的 VP1,VP2,VP3和VP4)、非結構蛋白(P2區編碼的2A,2B,2C以及P3區編碼的3A,3B,3C和3D)。目前研究表明BEV具有穩定的物理性狀、能夠抵抗腸道酸性環境、可通過腸道途徑進入宿主體內，且該病毒無毒力或毒力較弱。這些特性使BEV成為較好的疫苗候選載體。

牛病毒性腹瀉/粘膜病是由牛病毒性腹瀉病毒引起的傳染病,各種年齡的牛均易感染、以犢牛易感性最高,給我國乃至全球養殖產業帶來了嚴重的經濟損失。在BVDV病毒的結構蛋白中,E0蛋白保守性很高,并含有中和表位,產生的中和抗體具有中和BVDV的能力，被認為是BVDV亞單位疫苗的重要靶標抗原。

發明內容

針對上述問題，本發明的目的就在于提供一種表達BVDV-E⁰的重組牛腸道病毒的構建方法及其初步應用。

本發明通過以下技術方案來實現上述目的：

本發明包括牛腸道病毒，所述牛腸道病毒的感染性克隆毒株是BEV BJ101 株的克隆毒株，具有SEQ ID NO.1所示的全基因序列，其特征在于：所述感染性克隆毒株是通過反向遺傳操作的方法獲得BEV BJ101毒株的全長cDNA克隆并獲得拯救毒株rBEV后，將優化后的牛病毒性腹瀉病毒E0序列插入到BEV全長 cDNA中，獲得可穩定表達外源基因E0的重組牛腸道病毒，所述E0序列具有如SEQ ID NO.2所示。

具體地，在所述BEV全長cDNA的非結構蛋白2C和3A之間插入優化后的牛病毒性腹瀉病毒E0序列。

進一步地，所述牛病毒性腹瀉病毒的E0基因的優化包括在構建好的含有 GpBSK-rBEV的質粒的2A和3C基因序列之間插入牛病毒性腹瀉病毒的E0基因，對E0的基因序列先進行哺乳動物密碼子優化，再在其5’端添加合成GCCGGCCGC NotI酶切位點序列，在其3’端添加合成TCTAGA XbaI酶切位點序列(SEQ ID NO.2所示)，以便于通過NotI、XbaI雙酶切后與引入NotI、XbaI雙酶切位點的GpBSK-rBEV的質粒進行連接。

具體地，在構建好的含有GpBSK-rBEV的質粒的2C和3A基因序列之間通過重疊PCR的方法引入NotI和XbaI雙酶切位點.所述重疊延伸PCR引物包括3 對引物對，分別為：P23-F,P23-2AF和EcoR5-R，從5’端到3’端，引物對的具體序列如下：

P23-F: