[發(fā)明專利]一種miRNA-21的檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910653576.0
• 申請日: 2019-07-18
• 公開（公告）號: CN110387401A
• 公開（公告）日: 2019-10-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 余伯陽;田蔣為;黃浠桐
• 申請（專利權(quán)）人: 中國藥科大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682;C12Q1/54;C12Q1/44;C12Q1/34
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

本發(fā)明公開了一種miRNA?21的檢測方法，該方法在磁珠上偶聯(lián)底物鏈?蔗糖酶復(fù)合物，當(dāng)靶標(biāo)miRNA出現(xiàn)后與底物鏈雜交，雙鏈特異性核酸酶能選擇性地裂解在DNA/RNA雙鏈中的DNA并保持RNA的活性，釋放的miRNA進(jìn)行下一輪雜交循環(huán)；最后上清液中的蔗糖酶將蔗糖水解為葡萄糖，通過血糖儀檢測獲得輸出信號。本發(fā)明通過引入雙鏈特異性核酸酶和蔗糖酶對miRNA的檢測信號進(jìn)行雙酶放大作用，提高了檢測靈敏度，在10?200pM具有線性關(guān)系，檢測限為1.8pM，具有簡便、快捷、靈敏、高效等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微小RNA的檢測方法，特別涉及一種miRNA-21的檢測方法。

背景技術(shù)

microRNAs(miRNAs)是一類長約18-25nt的內(nèi)源性非編碼小分子，存在于血清、血漿或尿液等體液中，它通過與其靶mRNA分子的3’端非編碼區(qū)(3’UTR)互補(bǔ)結(jié)合，在翻譯水平上調(diào)控后基因的表達(dá)。因此，miRNAs參與生物體多種生理過程，控制細(xì)胞分化、增殖和凋亡。然而，由于其在體液中低濃度，短長度和高同源性的特殊性，實(shí)現(xiàn)快速，簡單，可靠和超靈敏的測定仍具有挑戰(zhàn)性。

現(xiàn)有miRNA檢測方式，大多需要昂貴的儀器設(shè)備和復(fù)雜的操作、冗長的等待時間。目前用于核酸檢測的方法主要有四種：southern和northern印跡法、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、DNA微陣列、新一代測序(NGS)。這些方法普遍具有耗時較長、檢測成本較高、需要大型昂貴儀器等的不足，此外對于操作人員專業(yè)知識有很高要求。這限制了miRNA檢測在家庭和臨床上的應(yīng)用。

血糖儀具有小巧易攜、價格便宜、方便使用等優(yōu)點(diǎn)，是目前一種在家庭中廣泛使用的血糖濃度測量儀器。雙鏈特異性核酸酶(Duplex-Specific Nuclease，DSN)是一種熱穩(wěn)定核酸酶，不需要特意的識別位點(diǎn)，能夠選擇性降解雙鏈DNA和DNA/RNA雜交體中的DNA，但對單鏈DNA/RNA核酸分子和雙鏈RNA分子幾乎沒有作用，能夠區(qū)分完全和不完全匹配的雙鏈體。鏈霉親和素磁珠既具有磁性，又能進(jìn)一步和修飾生物素的蛋白質(zhì)、抗體及核酸等多種生物分子偶聯(lián)，被廣泛應(yīng)用于免疫沉淀、免疫檢測(ELASA)及各類核酸、蛋白質(zhì)反應(yīng)。如何利用上述材料的特性，結(jié)合化學(xué)修飾的技術(shù)，研究出可以簡便檢測miRNA的方法，是值得本行業(yè)技術(shù)人員思考的。

現(xiàn)有技術(shù)中的miRNA檢測方法檢測時間長，操作復(fù)雜，還需要使用PCR才能完成檢測，或者熒光分光光度計等配合，對技術(shù)人員的操作技能要求比較高。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明目的是提供一種檢測靈敏度高和選擇性高的基于脫氧核酶和蔗糖酶的血糖儀檢測miRNA-21方法。

技術(shù)方案：本發(fā)明提供一種miRNA-21的檢測方法，包括如下步驟：

(1)以鏈霉親和素修飾磁珠為載體連接底物鏈(SEQ ID NO.1)-蔗糖酶復(fù)合物，形成檢測探針；

所述底物鏈的結(jié)構(gòu)為5’-生物素-自由鏈片段1-雜交片段-自由鏈片段2-3’；

所述自由鏈片段1的序列為：5’-aaaaa-3’；所述自由鏈片段2的序列為：5’-aaaaaaaaaa-3’；所述雜交片段的序列為：5’-tcaacatcagtctgataagcta-3’；底物鏈序列為5’-aaaaatcaacatcagtctgataagctaaaaaaaaaaa-3’(SEQ ID NO.1)。

(2)檢測探針棄去澄清溶液后加入待檢測miRNA-21(SEQ ID NO.2)、DEPC處理水、雙鏈特異性核酸酶緩沖液和DSN，進(jìn)行反應(yīng)，待測miRNA-21與檢測探針的雜交區(qū)域特異性結(jié)合，然后底物鏈中的雜交片段被雙鏈特異性核酸酶裂解，釋放miRNA-21，之后進(jìn)入下一輪雜交循環(huán)；

(3)將反應(yīng)溶液進(jìn)行磁分離，然后將澄清的上清液轉(zhuǎn)移到含有緩沖液A的蔗糖溶液中，進(jìn)行反應(yīng)；