[發明專利]一種miRNA-21的檢測方法

在審

• 申請號: 201910653576.0
• 申請日: 2019-07-18
• 公開（公告）號: CN110387401A
• 公開（公告）日: 2019-10-29
• 發明（設計）人: 余伯陽;田蔣為;黃浠桐
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682;C12Q1/54;C12Q1/44;C12Q1/34
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

1.一種miRNA-21的檢測方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)以鏈霉親和素修飾磁珠為載體連接底物鏈(SEQ ID NO.1)-蔗糖酶復合物，形成檢測探針；

所述底物鏈的結構為5’-生物素-自由鏈片段1-雜交片段-自由鏈片段2-3’；

所述自由鏈片段1的序列為：5’-aaaaa-3’；自由鏈片段2的序列為：5’-aaaaaaaaaa-3’；雜交片段的序列為：5’-tcaacatcagtctgataagcta-3’；

(2)檢測探針棄去澄清溶液后加入待檢測miRNA-21(SEQ ID NO.2)、DEPC處理水、雙鏈特異性核酸酶緩沖液和DSN，進行反應，待測miRNA-21與檢測探針的雜交區域特異性結合，然后底物鏈中的雜交片段被雙鏈特異性核酸酶裂解，釋放miRNA-21，之后進入下一輪雜交循環；

(3)將反應溶液進行磁分離，然后將澄清的上清液轉移到含有緩沖液A的蔗糖溶液中，進行反應；

(4)檢測產生的葡萄糖信號，獲得葡萄糖濃度值，根據miRNA-21與葡萄糖濃度的線性關系，計算miRNA-21的濃度值。

2.根據權利要求1所述的miRNA-21的檢測方法，其特征在于：所述步驟(2)中的雙鏈特異性核酸酶緩沖液包含50mM Tris-HCl，5mM MgCl₂和1mM DTT和1μL DSN(1U/uL)，pH值8.0。

3.根據權利要求1所述的miRNA-21的檢測方法，其特征在于：所述步驟(4)中利用血糖儀檢測產生的葡萄糖信號。

4.根據權利要求1所述的miRNA-21的檢測方法，其特征在于：所述檢測探針的制備方法為：

(1)制備底物鏈溶液：用DEPC水配制底物鏈，加入磷酸鈉緩沖液和溶解在DEPC水中的TCEP，將混合物在室溫下靜置后超濾純化；

(2)制備純化的sulfo-SMCC活化蔗糖酶溶液：用緩沖液A配制蔗糖酶溶液，與sulfo-SMCC混合；渦旋后，于室溫條件置于振蕩器上反應，離心除去過量sulfo-SMCC，然后用Amicon-100K和緩沖液A將溶液超濾純化；

(3)制備底物鏈-蔗糖酶復合物：將純化的sulfo-SMCC活化蔗糖酶溶液與底物鏈溶液混合，室溫下靜置；然后使用緩沖液A、超濾純化除去未反應的底物鏈；

(4)將底物鏈-蔗糖酶復合物和鏈霉親和素修飾磁珠偶聯：向磁珠溶液中加入緩沖液B，室溫下混合反應，最后，用緩沖液B洗滌除去未連接的DNA鏈。

5.根據權利要求1所述的miRNA-21的檢測方法，其特征在于：所述步驟(4)中miRNA與葡萄糖濃度的線性關系為：當miRNA-21濃度在10-200pM范圍內符合線性方程y＝2.98+0.12x，其中，y為血糖儀讀數，x為miRNA-21濃度。

6.根據權利要求1所述的miRNA-21的檢測方法，其特征在于：所述步驟(3)緩沖液A中含有氯化鈉和磷酸鈉，pH值7.3。