[發明專利]一種Cd2ap基因敲除動物的構建方法及應用

有效

• 申請號: 201910650999.7
• 申請日: 2019-07-18
• 公開（公告）號: CN110438160B
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 吳志英;陶青青
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/85;C12N15/113;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 北京領科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11690
• 代理人: 張丹

本發明提供了一種Cd2ap基因敲除動物的構建方法，及獲得的Cd2ap基因敲除動物在治療阿爾茨海默病的藥物篩選、藥效評價的應用。本發明還提供了一種特異性靶向Cd2ap基因的sgRNA序列、包含sgRNA序列的載體，及可以直接用于顯微注射的RNA。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種Cd2ap基因敲除動物的構建方法及應用。

背景技術

隨著功能基因組學的興起和發展，基因敲除技術被人們廣泛的用于探討基因功能的研究，通過基因敲除技術逐漸明確了大量模式生物和重要功能微生物的全基因組，并能準確定位功能基因，從基因水平上更加清楚的認識微生物的代謝規律。同時，基因敲除技術的完善可進一步推動微生物代謝工程的廣泛應用，通過基因敲除手段改變微生物細胞的代謝流向，阻斷有害代謝產物積累，制備基因敲除模式動物，用于特定藥物的藥效評價和藥物篩選。

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是原核生物基因組內的一段重復序列，是生命進化歷史上，細菌和病毒進行斗爭產生的免疫武器，簡單說就是病毒能把自己的基因整合到細菌，利用細菌的細胞工具為自己的基因復制服務，細菌為了將病毒的外來入侵基因清除，進化出CRISPR-Cas9系統，利用這個系統，細菌可以不動聲色地把病毒基因從自己的染色體上切除，這是細菌特有的免疫系統。本發明采用CRISPR-Cas9系統進行Cd2ap基因的條件性敲除。

Cd2ap基因位于17號染色體，其編碼一種調節肌動蛋白細胞骨架的支架分子(在神經元通路中的廣大連結區域聚積的蛋白分子)。該蛋白質直接與絲狀肌動蛋白、及通過多種肌動蛋白結合位點的各種細胞膜的蛋白質、SH3結構域，以及含有SH3結構域結合位點之富含脯氨酸區域等交互作用。胞質蛋白定位于膜皺褶，脂筏和細胞的前緣。它牽涉到在受體的內吞作用和胞質分裂發生動態肌動蛋白重塑和膜交換。

現有技術中，公開了Cd2ap基因的相關功能，例如，文獻：Cd2ap相關作用的研究進展，吝娜、王保興，中國中西醫結合腎病雜志，公開了Cd2ap基因敲除(Cd2ap-/-)的小鼠存在免疫功能缺損，于生后6-7周因蛋白尿和腎衰竭死亡。Cd2ap基因單倍缺失的小鼠(Cd2ap+/-)在出生后9月齡時出現腎小球改變并增加腎小球受傷的易感性，但其免疫功能仍正常。專利：CN107245502A公開了通過siRNA/shRNA，CRISPR/Cas9，CRISPR/cpf1，Talen或ZFNs來工作下調Cd2ap配伍，以降低Cd2ap與相關蛋白的相互作用劑，從而治療個體HCV感染、糖尿病。文獻：敲低CD2相關蛋白的表達對足細胞黏附和胞質伸展功能的影響，姜華軍、張春等，中華腎臟病雜志，公開了通過利用特異性Cd2ap siRNA來抑制足細胞中Cd2ap分子的表達，結果發現，敲低Cd2ap的表達對胞質伸展、細胞黏附、F-actin、nephrin蛋白和磷酸化水平的影響，且足細胞黏附和胞質伸展的能力下降，足細胞的凋亡可使部分細胞失去黏附作用，但足細胞骨架蛋白的紊亂和nephrin信號通路的抑制更可能是足細胞黏附和伸展功能下降的主要原原因。專利：CN103045729A公開了老年性癡呆病變前期Cd2ap基因mRNA水平原位雜交篩查試劑盒、方法及應用，該檢測試劑盒在mRNA水平上檢測Cd2ap基因的表達功能，比現有的臨床生化檢測指標和影像醫學檢查更早期，能夠實現真正的老年性癡呆(AD)病變前期mRNA水平的篩查，做到預防性診治的目的。

但上述現有技術均未公開敲除Cd2ap基因特定的功能區域，也沒有公開采用本發明人設計的特異性靶向基因的sgRNA及CRISPR/Cas9敲除的Cd2ap基因特定的功能區域，更沒有公開敲除Cd2ap基因特定的功能區域后的動物在治療阿爾茨海默病的藥物篩選或藥效評價中的應用。

發明內容

本發明的第一方面，涉及一種Cd2ap基因敲除動物的構建方法，所述的構建方法包括敲除Cd2ap基因的5號外顯子。