[發(fā)明專利]一種Cd2ap基因敲除動(dòng)物的構(gòu)建方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910650999.7
• 申請日: 2019-07-18
• 公開（公告）號: CN110438160B
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳志英;陶青青
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/85;C12N15/113;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 北京領(lǐng)科知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11690
• 代理人: 張丹

1.一種Cd2ap基因敲除動(dòng)物的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的構(gòu)建方法包括敲除Cd2ap基因的5號外顯子，所述的構(gòu)建方法包括使用靶向Cd2ap基因的sgRNA、Cas9和靶向載體在所述動(dòng)物Cd2ap基因的5號外顯子兩端各放置一個(gè)LoxP或Frt序列，獲得條件性Cd2ap基因敲除Flox動(dòng)物，將條件性Cd2ap基因敲除Flox動(dòng)物與表達(dá)Cre或Flp重組酶的動(dòng)物交配，利用Cre-loxP或Flp-Frt基因重組系統(tǒng)，獲得Cd2ap基因敲除動(dòng)物，所述的靶向5’端靶位點(diǎn)的sgRNA序列如SEQ ID NO：4所示，靶向3’端靶位點(diǎn)的sgRNA序列如SEQ ID NO：14所示，所述的靶向載體中含有Cd2ap基因的5號外顯子，其兩端各毗鄰一個(gè)LoxP或Frt序列，同時(shí)LoxP或Frt序列兩端還各延伸有所述5號外顯子的左右同源臂序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種Cd2ap基因敲除動(dòng)物的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的構(gòu)建方法包括：

1）將SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：14所示的sgRNA序列連入帶T7啟動(dòng)子的質(zhì)粒上，并進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，得到用于顯微注射的RNA；

2）向動(dòng)物受精卵細(xì)胞顯微注射靶向Cd2ap基因的靶向載體、Cas9和步驟1）制備的用于顯微注射的RNA；

3）培養(yǎng)步驟2）所述的經(jīng)過顯微注射的受精卵細(xì)胞，然后移植至受體雌性非人哺乳動(dòng)物的輸卵管內(nèi)發(fā)育；

4）從步驟3）中懷孕雌性后代中篩選獲得陽性F0代，將陽性F0代與表達(dá)Cre或Flp重組酶的動(dòng)物交配，利用Cre-loxP或Flp-Frt基因重組系統(tǒng)，獲得Cd2ap基因敲除動(dòng)物。

3.一種Cd2ap基因敲除的細(xì)胞，其特征在于，所述的細(xì)胞來源于權(quán)利要求1-2任一所述的Cd2ap基因敲除動(dòng)物的構(gòu)建方法構(gòu)建的Cd2ap基因敲除動(dòng)物，所述的Cd2ap基因敲除的細(xì)胞不會(huì)發(fā)育為動(dòng)物個(gè)體。

4.一種權(quán)利要求1-2任一所述的Cd2ap基因敲除動(dòng)物的構(gòu)建方法構(gòu)建的Cd2ap基因敲除動(dòng)物、權(quán)利要求3所述的Cd2ap基因敲除的細(xì)胞在治療阿爾茨海默病的藥物篩選、藥效評價(jià)的應(yīng)用。