[發明專利]一種Ube3a基因在Iso誘導的心肌肥大中的作用機制的研究方法

在審

• 申請號: 201910649672.8
• 申請日: 2019-07-18
• 公開（公告）號: CN110317831A
• 公開（公告）日: 2019-10-11
• 發明（設計）人: 李延飛;金月玲;李覺;王翠平;葉駿
• 申請（專利權）人: 上海健康醫學院;同濟大學;上海美湛生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12Q1/6883;G01N33/68
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 陸惠中;王永偉

1.一種Ube3a基因在Iso誘導的心肌肥大中的作用機制的研究方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)細胞分組：細胞分組分為Iso誘導分組以及基因敲除和過表達分組，Iso誘導分組將細胞培養采用六孔板鋪盤，每孔加入2ml細胞培養基，向對照組細胞培養基中加入2μl PBS作為安慰劑；Iso藥物誘導組均加入2μl 10mM的Iso溶液，制成Iso終濃度為10μM的細胞培養基，按照時間梯度依次培養12h、24h、48h，基因敲除和過表達分組將細胞培養采用六孔板鋪盤，每孔加入2ml細胞培養基，向陰性對照組加入2μl PBS作為安慰劑，敲除和過表達組中的對照組加入2μl PBS作為安慰劑，其他Iso誘導組制成Iso終濃度為10μM的細胞培養基，按照時間梯度依次培養12h、24h和48h；

(2)Ube3a基因的獲取：實驗準備后，取出-80℃冰箱中保存的大腸桿菌感受態細胞及Ube3a質粒置于冰上融化，再取一干凈的EP管依次加入30ul感受態細胞和3ul質粒，用移液器反復吹打混勻后冰浴15min，將冰浴15min后的EP管插入水浴浮板并迅速放入提前預熱至42℃的水浴鍋中熱激45s，再迅速放回冰上2min，向EP管中加入900μl LB液體培養基，放入37℃搖床，180rpm培養1h，查看培養物的渾濁度，在超凈臺中，根據培養的大腸桿菌細胞渾濁度，取一定量均勻地滴加在事先已經倒好板的含氨芐霉素LB固體培養基上，用涂布棒將菌液均勻地涂布開，置于生化培養箱中培養，待培養14-18h后，查看菌落生長情況，如果菌落密度達到60％-80％，終止生長，取數支干凈的15ml試管，向試管中分別加入4ml LB液體培養基，分別挑取不同的單克隆菌落接種于不同試管中，于37℃搖床，180rpm培養12-16h左右，小量質粒抽提；

(3)Ube3a腺病毒的包裝：實驗先通過PCR擴增獲得含有限制性內切酶酶切位點的Ube3a目的基因模板片段，然后通過內切酶將病毒載體雙酶切，通過T4連接酶將目的片段組裝到腺病毒載體中，構建重組Ube3a過表達腺病毒質粒，通過與骨架質粒的共轉染，包裝Ube3a過表達腺病；

(4)轉染：轉染包含siRNA的轉染以及腺病毒感染，siRNA的轉染步驟為合成的siRNA粉末用DEPC處理過的無菌水溶解，配制成20μM的溶液，然后根據轉染的細胞孔數計算需要配制的轉染液，一般對于3.5cm直徑的孔加入約7μl RNAiMAX和6μl合成的siRNA(3μl RNAi#1和3μl RNAi#2)溶液，腺病毒感染取5μl包裝好的1010滴度以上的腺病毒溶液直接加入到2ml細胞培養基中，腺病毒將自行侵染細胞；

(5)數據分析：數據通過使用SPSS16.0分析，組間的比較使用獨立樣本t檢驗分析，多組間的比較采用單因素Dunnett’s t檢驗(ANOVA Dunnett’s posthoc)，數據結果以Mean±SD表示，p<0.05表示有統計學上顯著性差異。

2.根據權利要求1所述的一種Ube3a基因在Iso誘導的心肌肥大中的作用機制的研究方法，其特征在于，所述步驟(2)中實驗準備步驟為在三角瓶中加入適量的雙蒸水配制預混的LB液體和固體培養基，將LB液體培養基、LB固體培養基、EP管和移液吸頭放入高溫高壓滅菌鍋中濕熱滅菌，將滅過菌的LB液體和固體培養基放入超凈臺中，待溫度降低后，加入氨芐霉素，混成千分之一氨芐的LB培養基，然后將固體培養基倒入培養皿中，每皿15ml左右，置于超凈臺中使其凝固，其他滅過菌的物品放入恒溫干燥箱中干燥，過夜干燥后用75％酒精噴灑后放入細菌操作超凈臺中紫外線照射30min。

3.根據權利要求1所述的一種Ube3a基因在Iso誘導的心肌肥大中的作用機制的研究方法，其特征在于，所述步驟(3)中腺病毒載體先進行腺病毒載體構建，再進行腺病毒載體的擴增。