[發(fā)明專利]一種固定化谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910634009.0
• 申請(qǐng)日: 2019-07-15
• 公開（公告）號(hào): CN110373406B
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 步國(guó)建;甘李;張玉如;寇雪蕊;和超楠;劉艷;賀曉潔
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 泰興市東圣生物科技有限公司;江蘇東匯生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N11/10
• 分類號(hào): C12N11/10;C12N11/02;C12N9/96;C12N9/10
• 代理公司: 上海德禾翰通律師事務(wù)所 31319
• 代理人: 夏思秋

本發(fā)明公開了一種固定化谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的制備方法，該方法利用葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、卡拉膠、明膠等天然高分子化合物固定化酶，將固定化好的包埋體浸入保護(hù)劑含有醇類、糖類、抗氧化劑等液態(tài)混合物中，使得固定化后酶制劑的穩(wěn)定性大大提升。本發(fā)明不僅大大延長(zhǎng)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在低溫、常溫和高溫下的保存時(shí)間，且使谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的穩(wěn)定性大大提高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物酶制劑的固定化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種固定化谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的制備方法。

背景技術(shù)

谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，是一種催化酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶，它能夠促使蛋白質(zhì)分子內(nèi)交聯(lián)，蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)以及蛋白質(zhì)和氨基酸之間的交聯(lián)，可以在很大程度上改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，提高蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，在食品加工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用。谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶最早在豚鼠肝臟中首次發(fā)現(xiàn)，1989年首次從茂源鏈霉菌中分離得到，1997年實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，2001年正式列為我國(guó)食品添加劑。谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶廣泛存于自然界中，按來(lái)源可以將它分成三類：動(dòng)物來(lái)源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，植物來(lái)源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶和微生物來(lái)源的谷胺酰胺轉(zhuǎn)胺酶。由于動(dòng)植物來(lái)源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶來(lái)源少且成本昂貴，而微生物具有繁殖速度快、產(chǎn)酶量高等特點(diǎn)，目前生產(chǎn)的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶主要通過(guò)微生物發(fā)酵獲得。

但是，目前微生物產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在高溫運(yùn)輸、保存、應(yīng)用方面仍有許多問(wèn)題需要解決，尤其是谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶液態(tài)酶制劑只能在低溫或是室溫下長(zhǎng)期保存，但在夏天或是炎熱地區(qū)運(yùn)輸，保存過(guò)程中很難提供穩(wěn)定低溫環(huán)境。因此開發(fā)一種可在較高溫度下(30℃或37℃)長(zhǎng)期穩(wěn)定保存的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶制劑是非常重要的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)存在的以上問(wèn)題，本發(fā)明創(chuàng)新提出將酶制劑的保護(hù)劑配方和酶的固定化相結(jié)合，解決引起酶活在常溫和較高溫度下容易損失的問(wèn)題，使制備得到的固定化谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶相對(duì)初始原酶，其穩(wěn)定性得到巨大提高。并且，相對(duì)目前市場(chǎng)已有的酶制劑，其穩(wěn)定也有大幅度的提高，在低溫、常溫和高溫下保存時(shí)間大大延長(zhǎng)。

本發(fā)明還提出了一種固定化谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的制備方法，即，利用固定化和浸入保護(hù)劑復(fù)合方法制成，包括如下步驟：

1)將含有葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、卡拉膠、明膠等天然高分子化合物中的一種或多種制備成載體懸浮液，加熱融化滅菌。

2)將滅好菌的載體懸浮液冷卻至室溫，加入pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH后，與游離態(tài)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶混合均勻，于2-8℃的條件下靜置。

3)然后加入戊二醛溶液，固定化交聯(lián)，然后，用去離子水洗滌，得到固定化體系。

4)將步驟3)得到的固定化體系浸入保護(hù)劑中，制備得到所述固定化谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶。

步驟1)中，所述加熱融化滅菌的溫度為115-121℃；優(yōu)選地，為115℃。所述加熱融化滅菌的時(shí)長(zhǎng)為20分鐘。

步驟2)中，所述pH調(diào)節(jié)劑為硫酸、乳酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鹽酸、Tris、檸檬酸、檸檬酸三鈉、純水中的任意一種或多種；優(yōu)選地，為磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、檸檬酸三鈉、純水。

步驟2)中，所述pH值為5.0-7.0；優(yōu)選地，為5.8-6.2。

步驟2)中，所述游離態(tài)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的初始濃度為500-1000U/mL，優(yōu)選為600-800U/mL；所述靜置的時(shí)間為10-60min，優(yōu)選為20-40min。

步驟2)中，所述靜止的時(shí)間為10-60min；優(yōu)選地，為20-40min。

步驟3)中，所述戊二醛溶液的濃度為0.05-2.00％(m/V)。

步驟3)中，所述交聯(lián)的時(shí)間為10-60min；優(yōu)選地，為20-40min。

步驟3)中，所述洗滌的次數(shù)為2-5次。