[發明專利]一種提取鮑肝胰腺RNA的方法有效

申請號：	201910633245.0	申請日：	2019-07-15
公開（公告）號：	CN110295164B	公開（公告）日：	2022-02-22
發明（設計）人：	姚托;盧潔;葉靈通;王江勇	申請（專利權）人：	中國水產科學研究院南海水產研究所
主分類號：	C12N15/10	分類號：	C12N15/10
代理公司：	廣州正明知識產權代理事務所(普通合伙) 44572	代理人：	余敏
地址：	510000 廣東***	國省代碼：	廣東;44
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種提取胰腺 rna 方法
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【說明書】：

本發明涉及分子生物學技術領域，特別涉及一種提取鮑肝胰腺RNA的方法，具體為：鮑肝胰腺在液氮中磨碎后用Trizol進行組織裂解，加入氯仿乳化，用異丙醇和5M NaCl沉淀，后轉入RNA吸附柱中，經75%乙醇和5M NaCl溶液洗滌，再經75%乙醇洗滌后用RNase?free水溶解得到鮑肝胰腺總RNA，總RNA經75%乙醇和5M NaCl二次沉淀和后續再純化，最終得到高質量的鮑肝胰腺總RNA，本發明不僅可徹底消除鮑肝胰腺總RNA沉淀過程中產生的褐色沉淀，使得到的鮑肝胰腺總RNA質量好、濃度高、穩定性好，而且操作簡單、成本低廉；同時，對其它多糖和色素含量高的水產動物組織總RNA的提取有借鑒作用。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，特別涉及一種提取鮑肝胰腺RNA的方法。

背景技術

鮑被譽為海產“八珍之冠”，具有很高的營養和藥用價值。2017年全國鮑魚產量為14.85萬噸，較2016年增幅10.24%，為經濟貝類養殖中產量增幅最快的品種，具有重要的研究價值。肝胰腺為鮑的重要免疫組織，在對其進行免疫學研究時，肝胰腺RNA的提取是一個重要的環節。實時熒光定量、Northern雜交及轉錄組測序等分子生物學研究的開展都需要純度高、完整性好的總RNA。

由于鮑肝胰腺中含有大量的多糖及色素，在RNA的提取過程中容易與RNA一起形成褐色沉淀，使得提取得到的RNA純度不高、檢測的總RNA含量不準，嚴重影響定量結果及cDNA文庫的構建，使得后續實驗無法進行。目前，傳統的Trizol提取方法可高質量的提取鮑外套膜、鰓和足的總RNA，但在肝胰腺總RNA的提取過程中會產生褐色沉淀且無法去除，市售RNA提取試劑盒對提取得到的肝胰腺總RNA質量僅能起到改善作用，也無法從根本上去除褐色沉淀，且RNA提取質量不穩定。因此，有必要建立一種適用于鮑肝胰腺總RNA的提取方法，以滿足響應分子生物學實驗的需求。

發明內容

為了克服上述現有技術的不足，本發明提出了一種提取鮑肝胰腺RNA的方法，采用該方法得到的鮑肝胰腺總RNA質量好，濃度高，穩定性好。

為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案是：

一種提取鮑肝胰腺RNA的方法，包括以下步驟：

S1、取鮑肝胰腺，在液氮中磨碎后，轉入含有Trizol的RNase-free EP(eppendorf)管中（該EP管一般為1.5 mL管），混勻后離心，取上清液轉入新的RNase-freeEP管中；

S2、往S1的上清液中加入1/5上清液體積的氯仿，通過震蕩等方式混勻充分乳化呈乳白色，室溫靜置2-5 min，離心后取上清液轉入新的RNase-free EP管中；

S3、往S2的上清液中分別加入與上清液等體積的異丙醇和5mol/L NaCl（即5 MNaCl），混勻，分兩次將得到的溶液和沉淀一起轉入RNA吸附柱中，離心后棄掉收集管中的液體；

S4、往S3的RNA吸附柱中加入75%體積分數的乙醇和5 M NaCl，室溫靜置2-5 min，離心后棄掉收集管中的液體；

S5、往S4的RNA吸附柱中加入75%體積分數的乙醇，室溫靜置2-5 min，離心后棄掉收集管中的液體；

S6、將S5的RNA吸附柱放入2 mL收集管中，離心2-4 min；

S7、將S6的RNA吸附柱充分晾干；

S8、將S7的RNA吸附柱轉入一個新的無RNase的1.5 mL離心管中，加入RNase-free水室溫放置2 min，離心后得到鮑肝胰腺總RNA；